Галлерия мелонелла инструкция по применению отзывы врачей

Настойка восковой моли: целебные свойства, противопоказания

Личинки восковой моли (галерия мелонелла) считаются ценным побочным продуктом пчеловодства. На их основе готовят уникальное средство – экстракт Мухина. С его помощью лечат различные заболевания, включая такие тяжелые, как туберкулез. Приобрести настойку восковой моли можно в интернет магазине honey-space.ru, где продается качественный, на 100% настоящий алтайский продукт.

Галерия мелонелла: гроза пчел или спасительница людей?

Личинка восковой моли – это гусеница бабочки-огневки (восковой моли). Бабочка обычно живет рядом с пасеками и летит откладывать яйца в ульи. Из яиц появляются гусеницы, поедающие пчелиный воск. Они прогрызают соты, выделяют продукты распада в мед и оплетают все в улье паутиной. Экскременты личинок имеют черный цвет и неприятный запах. За небольшое время гусеницы уничтожают все соты, обрекая на гибель от голода как личинок пчел, так и взрослых насекомых. Но при этом они единственные в мире насекомые, способные перерабатывать воск. Это свойство открыл знаменитый русский ученый-биолог и геронтолог И. Мечников. Он выяснил, что входящий в состав желудочного сока личинки огневки церраза полностью растворяет жировосковую оболочку бактерий туберкулеза, уничтожая их всего за 2-3 дня.

Эксперименты продолжил его ученик – С. Метальников, а с 1984 по 1991 – гомеопат Сергей Мухин. Он доказал, что свойства экстракта благотворно влияют на сердечно-сосудистую систему и другие системы организма человека. Именно Мухин разработал уникальный состав спиртовой настойки на личинках моли, которая стала очень популярным гомеопатическим средством.

От чего помогает настойка восковой моли?

Экстракт Меланиум официальная медицина не признает, считая, что его воздействие – это эффект плацебо (самовнушение). Но в народной медицине настойка личинок очень востребована. Судя по результатам и отзывам, это действеннее средство для лечения:

1. Туберкулеза, а также бронхитов, астмы, пневмонии.
2. Сердечно-сосудистых заболеваний (стенокардия, аритмия, инфаркт миокарда, повышенное давление, тромбофлебит, варикозное расширение вен).
3. Воспалений и рубцов, вызванных оперативным вмешательством.
4. Анемии.
5. Болезней печени, поджелудочной железы, желудка.
6. Бесплодия, некоторых женских болезней, в том числе раннего климакса.
7. Простатита, импотенции, мужского бесплодия.
8. Воспаление мочеполовой системы.
9. Кожных заболеваний (угревая сыпь, фурункулы, чирьи, псориаз и др.).
10. Заболевания сустав (артрозы, артриты).

Помимо этого, настойка личинок повышает иммунитет, нормализует обменные процессы в тканях и органах, повышает физическую выносливость и умственную активность. Она помогает очистить сосуды от холестерина, понижает уровень сахара в крови. Этот натуральный продукт считается хорошим средством для выведения из организма солей тяжелых металлов и токсинов. Например, с его помощью снимают симптомы тяжелого алкогольного отравления.

Кому не стоит принимать Меланиум

Из-за мощного воздействия на все системы организма, экстракт личинок восковой моли нельзя пить беременным женщинам и детям младше 14 лет. Категорически запрещено употреблять ее людям с аллергией на продукты пчеловодства. Всем остальным перед применением Меланиума надо обязательно проконсультироваться с хорошим врачом – при некоторых заболеваниях настойку принимать следует очень осторожно, либо вовсе избегать лечения с ее помощью.

Также по теме:

Восковая моль (Galleria Mellonella – большая восковая моль, восковая или пчелиная огневка, золотая бабочка) – вид молевидных бабочек-вредителей медоносных пчёл, поражает слабые пчелиные семьи или восковое сырьё, где откладывает яйца, из которых появляются гусеницы (личинки). Личинки сначала питаются маточкиным молочком, пыльцой, мёдом, прополисом и пергой, а повзрослев, поедают воск и повреждают структуру сот, нанося огромный вред пчеловодству.

Однако немногие знают о том, что восковая моль не только злейший вредитель, но и ценный биологически активный продукт. Её личинки – это единственные живые существа в природе, которые способны переваривать воск и накапливать широкий спектр биологически активных веществ, содержащийся в продуктах пчеловодства.

Эти удивительные особи наделены невероятной мощью и способностью оздоравливать практически все физиологические процессы в организме человека, поэтому вполне оправдано назвать Galleria Mellonella (GM) – природным лекарем и домашним доктором.

Важной особенность личинки золотой бабочки является выработка специфического фермента – церраза, который растворяет оболочку микобактерии туберкулёза, лишив её своей защиты. В результате бактерия теряет свою жизнеспособность и становится безопасной для нашего организма. Это явление было открыто ещё более 100 лет назад основателем теории иммунитета, лауреатом Нобелевской премии И.И.Мечниковым.

Известный гомеопат-кардиолог С.А.Мухин своими исследованиями подтвердил мощный иммуномодулирующий эффект и противотуберкулёзное действие экстракта личинок галерия мелонелла и открыл его новые целебные свойства и возможности применения в кардиологии.

Мы знаем, что сегодня показатели заболеваемости туберкулёзом очень высокие, причём растёт количество туберкулёзных больных с устойчивостью ко многим антибиотикам, а сердечно-сосудистые заболевания занимают первое место по количеству смертей, поэтому так актуален вопрос:

Как уберечь себя и своих близких от этих недугов?

Сиропы Bio GM с галерия мелонелла, которые предлагает компания «Эффектив Солюшнз Групп», дают нам такую возможность.

Экстракт личинок Galleria mellonella – базовая составляющая продуктов серии Bio GM – защищает органы дыхания, улучшает дренажную функцию бронхов, поэтому проявляет высокую эффективность при лечении пневмонии, бронхита, бронхиальной астмы, аллергических проявлений, а также грибковых заболеваний лёгких, которые являются частыми осложнениями курсов химиотерапии туберкулёза. Помимо этого, экстракт способен заживить туберкулёзные каверны в лёгких, устранить рубцы после инфаркта миокарда, вылечить атеросклероз и стенокардию.

Препараты Bio GM обладают широким спектром биологической активности: биостимулирующей, анаболической, кардиозащитной, адаптогенной, снижают токсичность сердечных гликозидов, улучшают реологические свойства крови, стимулируют кроветворение, снижают уровень холестерина, уменьшают обструкцию бронхов, повышают физическую выносливость. Основа препаратов – экстракт личинок Galleria mellonella – мощный естественный иммуностимулятор, повышающий защитные силы и сопротивляемость организма различным заболеваниям.

Регулярный приём препаратов Bio GM помогает выдерживать интенсивные умственные и физические нагрузки, преодолевать стрессовые ситуации, уменьшает вредные последствия травм и операций. Установлено, что препараты на основе GM положительно влияют на настроение, улучшают память, концентрацию внимания и способность к обучению, что обусловлено наличием аминокислот – предшественников серотонина (фенилаланин и триптофан), которыми обогащён экстракт личинок огневки. Galleria mellonella благотворно воздействует на обмен веществ, снижает уровень сахара в крови, эффективна при лечении анемии, глазных болезней (глаукомы, катаракты, отслоения сетчатки), гипертонии, рассеянного склероза, вирусного гепатита, обладает антипаразитарным действием, замедляет процессы старения организма и увеличивает продолжительность жизни.

Известно, что жены фараонов в древнем Египте использовали личинки восковой моли в качестве средства продления молодости и сохранения красоты.

Омолаживающий эффект даёт смесь из трёх незаменимых аминокислот (лейцин, изолейцин и валин), которую итальянские учёные считают «эликсиром молодости». К тому же, из этих трёх аминокислот синтезируется аминокислота – аланин – важный источник энергии для головного мозга и центральной нервной системы.

Как мы помним, незаменимые аминокислоты, ни при каких условиях, не синтезируются в организме человека, поэтому для нормальной жизнедеятельности, они должны постоянно поступать извне. Всего в вытяжке из личинок восковой моли содержится 20 свободных аминокислот, в т.ч. 9 незаменимых, а также ферменты (щелочная сериновая протеаза, церраза), ксантин и гипоксантин, эссенциальные полиненасыщенные жирные кислоты семейства Омега, моно- и дисахариды, нуклеиновые основания и их производные, витамины, биологически важные макро- и микроэлементы (очень много магния и цинка), компоненты, стимулирующие рост и развитие клеток.

В традиционной медицине с давних времён использовали личинки Галерия Мелонелла для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, туберкулёза, импотенции и других возрастных изменений. До сих пор лечебные свойства восковой моли исследуются учёными разных стран. Список заболеваний, которые может вылечить или предотвратить это поитстине волшебное средство постоянно пополняется, так например, украинские учёные считают, что уникальные вещества, содержащиеся в экстракте личинок GM, способны победить рак.

Препараты на основе вытяжки Galleria Mellonella успешно применяются в гинекологии при лечении климактерического синдрома, слабой половой активности, патологической беременности, мужского и женского бесплодия. Благодаря этому чудо-доктору многие женщины познали радость материнства. При изучении фармакологических свойств экстракта было установлено, что препарат малотоксичен, не имеет противопоказаний, побочных эффектов и стабилен при хранении.

На сегодняшний день, только в Алтайском крае налажено промышленное производство продукции на основе экстракта восковой моли, так как в других регионах невозможно собрать необходимое и достаточное количество сырья.

Компания Effective Solution Group (ESG) совместно с ведущими технологами разработала новое поколение препаратов Bio GM на основе личинок Galleria mellonella, которые дополнены различными растительными экстрактами направленного действия. Серия уникальных продуктов Bio GM является для нас средством первой помощи в лечении и профилактике заболеваний пищеварительной, бронхо-лёгочной, сердечно-сосудистой, иммунной и других систем.

Вся линейка продукции сертифицирована и имеет сертификат BOSTI – системы добровольной сертификации биологически активных веществ природного происхождения.

(смотреть в полном размере)

Сертификат получен в целях подтверждения высокого качества и безопасности продукции, повышения конкурентоспособности на территории России и стран Таможенного Союза, а также в целях беспрепятственного выхода на международный рынок.

Купить качественный и доступный по цене продукт Алтайских производителей можно в нашем Интернет-магазине.

Компания ESGroup разработала комплексные программы по оздоровлению всех органов и систем нашего организма, в основе которых главный продукт компании – эксклюзивный БИО-Нектон, а начинается оздоровление с детокса – очищения организма от паразитов и продуктов их жизнедеятельности.

Для своих партнеров компания предлагает щедрый компенсационный план, который позволяет бесплатно приобретать продукцию для омоложения и оздоровления себя и своих близких, а также получать вознаграждение за рекомендации другим людям.

Приглашаем Вас присоединиться к нашей сплоченной команде, чтобы участвовать в акциях компании, программах финансового поощрения и достигать поставленных целей вместе с нами!

Остались вопросы? Обращайтесь в скайп: LaminineSupport или по телефону +79069425639 (приложения Viber и WhatsApp), с удовольствием ответим.

Статья обновлена 03.01.2021

Пчелиная восковая моль – это ночные бабочки, гусеницы которых питаются воском, пергой, подмором, остатками коконов пчелиных личинок. На безрыбье – сухофруктами, виноградом, яблоками, сахаром или высохшими насекомыми. Что лечит настойка восковой моли и как ее употреблять — узнаете в этой статье.

Другие названия : огнёвка пчелиная, клочень, мотылица, шашень, галерия мелонелла.

Более редкие их родственницы – южная амбарная огнёвка, мельничная огнёвка и сухофруктовая огнёвка.

Почему восковую моль называют огнёвкой? Да все просто — настой из неё получается красноватый, к тому же на спирте – настоящая огненная вода. Но это все народные названия. Официальное название пчелиной моли — Галлерия Мелонелла.

Полезные свойства и вред огнёвки

Вред очевиден:

• Личинки едят соты ( в улье, и на складах). Одна маленькая личинка за жизнь (за месяц) съедает 1,2 г сота (400 ячеек!).
• Ест мёд, пыльцу, пергу.
• Убивает расплод — за жизнь может испортить 11 личинок пчел. Личинка прогрызает ячейки с расплодом, повреждает крылья и ноги. Такой расплод даже не запечатывают – либо запечатывают только края, а в середине оставляют большую дыру. Если съеденная личинка уже была запечатана, пчёлы её открывают и тоже надстраивают «горлышко» ячейке, чтобы в этом районе матка не откладывала яйца.
• Огневка — переносчик гнильцов (инфекционные заболевания).

А вот про полезные свойства огневки следует поговорить отдельно. Собственно, это и есть основная цель этой статьи. Полезными свойствами обладают не сами бабочки, а только личинки восковой моли. Да и те — строго определенного качества и размера.  Чтобы хоть как-то минимизировать ущерб от личинок восковой моли, пчеловоды научились делать из неё целебную настойку. Лечебные свойства такого лекарства выше, если личинки бабочки Галлерии ели тёмную сушь (были эксперименты на крысах и лягушках!). В тёмной суши меньше воска (50% вместо 70%), но больше полезных пчелопродуктов – маточного молочка, покровы и оболочки личинок и пр.), а значит, выше биологическая ценность. При переработке этих веществ личинками огневки , они становится биологически активными.

В составе личинок:

Липаза и сериновая протеаза, то есть расщепляющий белки фермент протеаза с активным веществом серин. Серин впервые нашли в шёлке, а восковая моль тоже вырабатывает шёлковые нити. Липаза и протеаза — ферменты пищеварительные, соответственно, и действуют в основном на желудочно-кишечный тракт, включая печень и желчный пузырь. Они помогают организму усваивать больше полезных веществ. Липаза расщепляет жиры, протаза – белки.

Хитозан, который выводит жиры и расщепляет холестериновые бляшки.

Полезные микроэлементы: железо (очень много), калий, магний (для мышц), марганец, медь, молибден, селен, фосфор, хром, цинк, кобальт.

Сомнительный фермент цераза. Его пытались изучать в 1800-1900-х годах (русские, поляки, американцы, арабы), но до конца так не разработали по неизвестным причинам. До сих пор официально не числится ни в одном списке ферментов. Зато есть два патента:

• Американский патент на добычу церазы из восковой моли. Ричард Лисет утверждает, что цераза – это пероксидаза, то есть железосодержащий фермент, ускоряющий окисление воды и кислорода до перекиси водорода. Перекись у нас в организме вырабатывают клетки иммунитета – лейкоциты и гранулициты. Она участвует в обмене веществ, убирает лишний сахар, токсины и свободные радикалы а также борется с чужеродными веществами – вирусами, грибками, инфекциями.
• Русский патент на получение биологически активного продукта из личинок пчелиной моли.

Не путать церазу с:

• Огурцом. Cerasee (Момордика харанция) – ямайский горький овощ наподобие тощего огурца, он же – горькая китайская тыква.
• Вишней. Cerasa – с итальянского – вишня (англ. – cherry, лат. — cerasum).

Применение настойки Галерии Мелонеллы в народной медицине

Настойка восковой моли применялась в народной медицине с 1600-х годов. Первооткрыватель неизвестен, но народные рецепты приготовления настойки на полном серьёзе используются и даже модифицируются современными пчеловодами для повышения лечебных свойств. Например украинский пчеловод В.Громовый обнаружил, что концентрация активных веществ гораздо больше не в теле личинок огневки, а в их экскрементах. Компьютерная диагностика спиртовых экстрактов личинок и экскрементов по методу Фолля (электрическое сопротивление) выявила десятикратную концентрацию биологически активных компонентов в растворе с экскрементами, который и по цвету был гораздо насыщеннее.

Обширных клинических исследований проведено не было, официальной медициной восковая моли не рассматривается как лекарство от чего бы то ни было. Однако, народные целители успешно применяют личинки огневки для лечения огромного количества заболеваний.

Неофициальная медицина ставила и до сих пор ставит разные эксперименты. Так гомеопат С.А. Мухин обнаружил, что настойка из личинок рассасывает рубцы на сердце после инфаркта, а его коллега по патенту Н.А. Спиридонов выяснил, что настой из личинок, питавшихся тёмными сотами, защищает сердце и улучшает обмен веществ.

Кандидат биологических наук В.Ф. Баканева в своей диссертации опубликовала выводы о том, что сериновая протеаза (пищеварительный фермент личинок огневки) рассасывает бляшки и тромбы в сосудах, клетках сердца и легочной ткани. В экспериментах на кроликах замечено снижение артериального давления на 17%.

Нашла настойка ПЖВМ применение и в диетах. Ведь если у человека недостаток липазы, жиры преотлично откладываются на бёдрах и талии. Восстановить липазу можно с помощью личинок огневки. Ожирение, а также болезни от переизбытка жирной пищи – инсульты, холестериновые бляшки и закупорка сосудов — уйдут.

В интернет-аптеках можно найти пузырьки с загадочной абревиатурой ПЖЛВМ или ПЖВМ — это и есть наша настойка. Расшифровывается как продукт жизнедеятельности восковой моли.

Применение настойки ПЖВМ при онкологических заболеваниях

Эффективность средства при лечении рака посредственная. Настойка из личинок мало что лечит в этом случае. Она лишь:

• уничтожает свободные радикалы;
• улучшает обмен веществ:
• укрепляет иммунитет, облегчая ему работу по уничтожению бактерий и вирусов (лишает их защитной оболочки).

Принимать настойку из личинок восковой моли можно для профилактики и чтобы восстановиться после химиотерапии.

Применение настойки личинок при болезнях сердца

В.Ф. Баканева в диссертации опубликовала вывод, что лечение настойкой огневки стимулирует сократительную активность сердца на 55%, а предсердия — на 20%, так как содержит кислые пептиды из естественного корма личинок — тёмной восковой суши. Также настойка огневки пчелиной защищает сердце при передозировке сердечными гликозидами. Сердцезащитные свойства тестировали на лягушках – у них она повышает устойчивость сердечной мышцы к токсическому действию строфантина.

Для профилактики заболеваний сердца можно принимать  30 капель 2 раза в день на протяжении месяца

Применение настойки восковой моли при туберкулёзе

В некоторых больницах, с согласия пациентов, настои на личинках огневки применяют как дополнительное средство при заболеваниях легких, включая туберкулёз. Нобелевский лауреат Илья Мечников экспериментально подтвердил, что воскопереваривающий фермент личинок расщепляет защитный восковой слой палочки Коха (возбудителя туберкулёза). Однако, к этому способны только молодые личинки, старые не осиливают бактерии туберкулёза. Гомеопат С.А. Мухин обнаружил, что средство из пчелиной моли заполняет изъеденные туберкулёзом лёгкие живой тканью.

Для лечения туберкулеза препарат принимают 2 раза в день, из расчета: 40 капель утром (при тяжелой форме допускается увеличение дозы до 45 капель, но увеличивать ее нужно постепенно) и 40 капель вечером в сочетании с настойкой прополиса 20% за пол часа до еды.

Применение настойки ПЖВМ при диабете

Инсулин вырабатывается в поджелудочной железе, а это – часть желудочно-кишечного тракта, который очень хорошо лечит наша настоечка. Экстрактом пчелиной моли можно вылечить:

• Диабет первого типа – недостаточную выработку инсулина поджелудочной железой. Настой моли лечит весь ЖКТ, включая поджелудочную железу.
• Диабет второго типа – нарушение функций рецепторов инсулина из-за ожирения. Липаза из настоя расщепляет жиры, а другие вещества восстанавливают обмен веществ и выводят лишний сахар.

Применение настойки огневки в гинекологии

Действие настойки Галлерии Мелонеллы основано на свойстве пищеварительного фермента – сериновой протеазы – расщеплять оболочки вирусов и бактерий (он даже пластик берёт!). Вредоносные микроорганизмы лишаются защиты, и иммунные клетки их запросто уничтожают сами.

Применение настойки пчелиной моли при беременности

До беременности можно пить настойку, чтобы повысить тонус гладких мышц матки, чтобы не было разрывов и проще проходили роды. В организме восковой моли много железа – настойкой из личинок огневки пчелиной можно профилактикровать анемию.

Во время беременности врачи советуют не экспериментировать с любыми народными лекарствами, иначе можно навредить плоду.

Применение настойки ПЖВМ в спорте

В НИИ спорта (Москва) препарат из личинок восковой моли тестировали на велосипедистах. У них выросла масса и сила мышц, повысилась антистрессовая активность организма. Надеемся, что к допингу в ближайшее время это не отнесут.

Адаптогенность (выносливость к физическим нагрузкам) проверяли ещё и на крысах-самцах. Давали одной группе экстракт личинок огневки, другой группе – просто 40% этанол. Проверяли каждые 5 дней в течение месяца — устраивали плавание с 20-граммовым грузом. Экстракт пчелиной моли подтвердил эффективность.

На крысах-самцах тестировали также усиленный обмен веществ и получение энергии – опять успешно.

Правильные дозы настойки ПЖВМ для взрослых и детей

Отдельное внимание следует  уделять тому, как правильно принимать восковую моль, ведь это все-таки лекарство (хоть и народное), а лекарство нужно принимать в соответствии с режимом и инструкцией. За один-два приема вы не заметите и не получите никаких улучшений. Принимать народное средство нужно курсом.

Дозировка для взрослых

• начинать по 1 чайной ложке раз в день;
• потом – 2 ч.л. в день;
• максимум — 1 ст. ложка 3 раза в день.

Лучше не разбавлять и не смешивать с едой.

Дозировка для детей и кормящих матерей

По нескольку капель, разбавлять водой или заедать чем-то приятным. Аналогично при беременности и кормлении грудью: несколько капель, большие дозы и спирт могут повредить плоду.

1 капля на 1 год жизни ребенка. Применяется 2 раза в день на протяжении месяца.

Длительность полного курса зависит от того, хотите ли вы что-то вылечить или принимаете ПЖВМ только для профилактики. При лечении доза препарата и длительность приема будет выше. Минимальный срок приема — не менее 3 месяцев.  Что же касается дозы препарата, то она зависит от веса пациента. Примерную таблицу для расчета можно найти в инструкции по применению.

Максимальный эффект от приема достигается если ее не сразу глотать, а помещать под язык.

Формы выпуска ПЖВМ

Огневки пчелиной настойку можно заказать в Интернете:

• бальзам доктора Мухина «Вита» — препараты из растительного сырья с экстрактом личинок;
• бальзам доктора Рачкова «Витамедин», содержащий мед с экстрактом личинок,
• комплексный препарат «Галерин».

Известны и другие формы:

• Сушёные экскременты восковой моли;
• Настойка экскрементов;
• Суппозитории с экстрактом личинок и прополиса для гинекологических проблем.

И, конечно, использование в гомеопатии – у каждого гомеопата своё.

Противопоказания ПЖВМ

Последнее, что нужно знать о настойке пчелиной моли – противопоказания:

• алкоголизм;
• острые заболевания ЖКТ;
• индивидуальная непереносимость компонентов (особенно если это смесь с травами).

Не мешайте спиртовые растворы с лекарствами. Не заменяйте лекарства личиночными препаратами! Начинайте принимать маленькими порциями и внимательно следите за состоянием организма!

Отзывы о применении восковой моли

Мы взяли на себя труд собрать несколько отзывов о том, что происходит со здоровьем после приема настойки восковой моли. На самом деле их гораздо больше, но для общего понимания картины должно хватить и этого. Если вдруг этих отзывов будет недостаточно, то просто наберите в поисковике «настойка восковой моли отзывы» и увидите все сами.

Нина, 30 лет:
«Устала болеть. С этого месяца принялась укреплять иммунитет. Села на витаминизированную диету– больше свежих овощей и фруктов, а еще по совету бабушки купила настойку восковой моли. Сказала, простуды не будет. Уже скоро Новый Год,  а я еще ни разу не простыла! Спасибо, Бабуль ))) »

Мария Викторовна, 45 лет:
«Есть у одного из наших друзей своя пасека.  Услышала краем уха о волшебных свойствах настойки восковой моли. Заинтересовалась, почитала отзывы в интернете и решила  попросить его насобирать немного личинок в баночку, если получится. Настойку готовила самостоятельно, ничего сложного в этом нет. Принимаю настойку пока всего один месяц, но уже заметила, что стала утром просыпаться и высыпаться намного лучше! »

Ильдар, 38 лет:
«Замечательное средство от простуда и кашля. Жаль только в аптеках его не так просто найти. Уже не помню, когда сопливился последний раз.»

Отзывы врачей гораздо менее восторженные, но оно и понятно. Главный принцип врача — не навреди. А 90% подобных настоек — самоделки. Кто и что там намешал — неизвестно.

Петр
Не советую использовать сей сомнительный препарат для лечения таких серьезных заболеваний, как туберкулез или онкология. Говорю по собственному опыту (работаю врачом уже более двадцати лет): поддаваясь на уловки знахарей, люди тратят драгоценное время, в течение которого могли бы пройти комплексное лечение и улучшить свое состояние.

Ни одно фармакологическое предприятие не занимается выпуском экстракта или настойки восковой моли. Приобрести средство можно исключительно в пчеловодческих хозяйствах, причем как самих личинок бабочки, так и уже готовый продукт.

Если вы все решитесь принимать настойку восковой моли, посоветуйтесь с врачом. Хуже от этого точно не станет. А еще лучше вообще не болейте!

270 Вестник СамГУ — Естественнонаучная серия. 2007. №9/1(59).

УДК 519.999

ВЫДЕЛЕНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ ИЗ ГЕМОЛИМФЫ ЛИЧИНОК GALLERIA MELLONELLA

© 2007 П.П.Пурыгин, О.С. Срибная,1 Н.А. Кленова, Д.Н. Худякова;2

Е.Г. Литвинова, М.Н. Кондрашова, А.А. Овсепян3

В работе исследована антибактериальная активность гемолимфы иммунизированных личинок Galleria mellonella. С помощью ионообменной хроматографии и гель-электрофореза из гемолимфы выделены белковые фракции с антибактериальной активностью. Масс-спектрометрический анализ фракций показал присутствие пептида с массой 5627 Да. По-видимому, данный пептид и определяет антибактериальную активность гемолимфы.

Введение

В настоящее время насекомые привлекают к себе пристальное внимание исследователей как источники биологически активных веществ. В последние годы из насекомых выделено большое число антимикробных пептидов, которые по силе действия сопоставимы с антибиотиками и могут быть использованы для лечения бактериальных и грибковых инфекций [1-3].

Уникальным представителем мира насекомых является большая восковая моль Galleria mellonella L из семейства огневок (Pyralidae, Lepidoptera). Большая восковая моль уже несколько веков используется в народной медицине как средство для лечения туберкулеза и мужского бесплодия. Она получила свое название за чрезвычайно редкую для животных способность переваривать и усваивать пчелиный воск, благодаря наличию фермента церазы. Наличие этого фермента позволяет личинкам переваривать и воскоподобные оболочки туберкулезных бактерий.

В народной медицине и гомеопатии широко используется биологически активный препарат из личинок большой восковой моли Galleria Mellonella для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, а также в качестве антитуберкулезного и гери-артрического средства [4]. Особенности физиологии и питания личинок большой восковой моли, развивающихся в пчелином улье и поглощающих значительные количества биологически активных продуктов пчелиной семьи, их способность расщеплять и усваивать пчелиный воск представляют научно-практический интерес.

1 Пурыгин Петр Петрович (purygin2002amail.ru), Срибная Олеся Сергеевна, кафедра органической химии Самарского государственного университета, 443011, Россия, г.Самара, ул.Акад. Павлова, 1.

2 Кленова Наталья Анатольевна, Худякова Дарья Николаевна, кафедра биохимии Самарского государственного университета, 443011, Россия, г.Самара, ул.Акад. Павлова, 1.

3 Литвинова Елена Геннадьевна, Кондрашова Мария Николаевна, Овсепян Армен Александрович, лаборатория метаболической биохимии, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Россия, г.Пущино, ул.Институтская, 3.

Проведенные исследования состава и механизма действия экстрактов личинок служат предпосылкой для создания новых лекарственных препаратов, включающих активные компоненты личинок [5-8].

В связи с потенциальной ценностью препарата Galleria Mellonella для медицины заслуживает внимания вопрос о наличии в составе экстракта личинок большой восковой моли, помимо антитуберкулезных факторов, иных биологически активных компонентов. В нашем предыдущем исследовании было показано, что спирто-вый экстракт личинок обладает антибактериальной активностью. Антибактериальная активность была ассоциирована с пептидной фракцией экстракта [9]. Учитывая, что не все биологически активные компоненты личинок переходят в экстракт, в настоящей работе было проведено выделение антибактериальных пептидов из гемолимфы личинок Galleria mellonella.

1. Материалы и методы исследования

1.1. Иммунизация личинок Galleria Mellonella и получение гемолимфы

Личинки большой восковой моли выращивались в питомнике ИТЭБ РАН на специально разработанном корме. Для эксперимента были отобраны целые, подвижные особи, находившиеся в стадии развития, предшествующей окукливанию. Средний вес личинок составил 100±20 мг. Количество личинок в первой серии экспериментов—28, второй — 96. Иммунизацию проводили по методу [10]. Каждой личинке была произведена инъекция 5 мкл 1000 кратно разведенной суспензии бактерий Pseudomonas aeruginosa. Далее личинки 48 часов выдерживали в термостате при температуре 28°С. Через 48 часов после иммунизации гемолимфу личинок первой серии экспериментов фракционировали для выявления бактерицидных компонентов.Гемолимфу второй серии использовали для определения антибактериальной активности без предварительного фракционирования.

Гемолимфу личинок получали, как описано в работе [10], прокалывая иглой верхнюю часть брюшка и надавливая на брюшную полость. В собранную гемолимфу помещали кристаллик тиомочевины, используемый в качестве ингибитора протеолиза и меланизации.

Чтобы подготовить гемолимфу личинок первой серии к фракционированию, к ней добавили 0,7 мл 0,15 М цитрат-фосфатного буфера рН 5,1. В 2 мл полученного раствора гемолимфы добавили 10 мкл твина. Образец нанесли на колонку.

К гемолимфе личинок второй серии добавили 6 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,2. Полученный раствор хранили при температуре -180 °C.

1.2. Получение экстракта личинок Galleria Mellonella, лишенных гемолимфы

В личинки, лишенные гемолимфы, добавляли 25 мл 70% этанола. Экстракцию проводили в темном месте при комнатной температуре в течение 12 дней. К полученному экстракту добавляли 10 мл хлороформа. В образовавшейся двухфазной системе отделяли нижний (хлороформный) слой от верхнего. Верхний слой составил 5 мл. К данному слою добавляли в малых количествах предварительно мелкоизмельченный аммоний сернокислый до полного насыщения раствора. По-

лученный раствор центрифугировали 10 минут при 4200 об/мин для отделения осажденного белка.

К белковому осадку добавляли 2 мл 0,15 М цитрат-фосфатного буфера рН 5,1. Белки растворились частично. Образец нанесли на колонку.

1.3. Фракционирование белков гемолимфы и экстракта личинок

Для ионообменной хроматографии использовали колонку (15×0,7 см), заполненную сефадексом СМ-50. Колонку уравновешивали цитрат-фосфатным буфером с рН 7,2 , затем с рН 5,1 (0,15 М). Градиент создавали изменением молярности цитрат-фосфатного буфера с рН 5,1 от 0,15 М до 1 М.

Измерение оптической плотности проводили на двулучевом спектрофотометре UVIKOM 923 Double Beam UV/BIS и на спектрофотометре ЛОМО СФ-46.

Концентрацию белка в полученных экстрактах и фракциях определяли по методу Варбурга и Кристиана [11]. Концентрацию белка вычисляли по формуле:

С(мг/мл)=1,55А280 — 0, 76260.

1.4. Определение антибактериальной активности

В качестве тестового микроорганизма использовался суточный инокулят E.coli, выращенный на среде следующего состава: г/л пептон — 5 г; глюкоза —10 г; NaCl —4,68 г; KCl —1,49 г; NH4CI —1,07 г; CaCb —0,44 г; трис —6, pH= 7,0; K2HPO4 — 1,55 г; MgSO4 — 5 г.

Бумажные диски с диаметром 0,6 см предварительно стерилизовали с помощью бактерицидных ламп. Стерильные диски пропитывались фракциями и помещались во влажном состоянии на свежие посевы E.coli. Количество повторов для каждой пробы равно 8. Посев проводился в микробиологическом боксе на чашки Петри методом распределения по поверхности шпателем Дригальского, после чего чашки Петри помещались в термостат при 37 °C на двое суток. Антибактериальная активность определялась по размерам зон ограниченного роста E.coli (наличие единичных точечных колоний или отсутствие колоний) вокруг дисков, пропитанных фракциями гемолимфы. Контролем служили диски, пропитанные растворителем (0,15 М цитрат-фосфатный буфер рН 5,1—для фракций гемолимфы иммунизированных личинок первой серии; 0,1 М фосфатный буфер рН 7,2 — для раствора гемолимфы иммунизированных личинок второй серии). Пробы на антибактериальную активность растворов разделенных электрофрезом белков, экстрагированных из геля, проводились по вышеописанной методике, в качестве контроля использовали раствор, полученный из фрагмента геля, не содержащего белка. Достоверность результатов оценивалась с помощью критерия Стьюдента [12].

1.5. Электрофорез

По результатам микробиологического тестирования пяти фракций гемолимфы личинок первой серии для электрофореза были выбраны 2 фракции (№ 3 и № 6), обладающие наибольшей антибактериальной активностью.

Кроме того, был проведен электрофрез гемолимфы иммунизированных личинок из второй серии экспериментов. Для этого 0,5 мл раствора гемолимфы иммунизированных личинок второй серии отцентрифугировали, отделили надосадоч-

ную жидкость, к осадку прилили 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,2 и для полного его растворения подкислили фосфорной кислотой.

0,5 мл каждого исследуемого раствора белка смешивали с 0,5 мл 40% раствора сахарозы и наслаивали на слой геля в каждой электрофоретической ячейке.

Для фракций гемолимфы личинок первой серии было сделано 2 повтора (2 электрофореграммы), а для раствора гемолимфы личинок второй партии и осадка из данного раствора 3 повтора (3 электрофореграммы).

Электрофорез проводили в 7,5% полиакриламидном геле (ПААГ) в щелочной боратной буферной системе (рН 9,2). Для электрофореза использовали универсальный источник питания УИП-1, реактивы и камеру фирмы ”Кеапа1”. В качестве маркерного красителя в верхний буфер добавлен бромтимоловый синий. Первые 30 минут электрофорез проводили при силе тока 100 мА, затем повысили до 200 мА. Электрофореграммы окрашивали 0,5% амидочерным В в течение 7 мин. Электрофореграммы отмывали от избытка красителя 7% уксусной кислотой в течение 28 дней.

Денситометрическое определение проводили на анализаторе фракций. Электро-фореграммы помещали в анализатор таким образом, чтобы сканирование происходило от старта к финишу. Интервал сканирования равен 6 см.

1.6. Элюция белков с электрофореграммы

Из электрофореграммы вырезали фрагменты геля, содержащие анализируемый белок, размером 3 X 4 мм и растирали в гомогенизаторе. Белки из измельченного геля экстрагировали дистиллированной водой (1,5 мл) в течение суток при 40 °С. Во время элюции суспензию измельченного геля встряхивали. После окончания экстракции гель удаляли центрифугированием.

1.7. Масс-спектрометрический анализ

Масс-спектрометрический анализ экстрагированных из геля белков проводили на масс-спектрометре Вгикег иНгаАех БаНюшсв методом матричной лазерной де-сорбционной ионизации (МЛДИ).

В качестве матрицы использовали раствор циано-4-гидроксикоричной кислоты в изопропаноле концентрацией 10 мг/мл.

Раствор матрицы (0,5-2 мкл) наносили на специальную плашку, затем после испарения растворителя матрицы сверху наслаивали анализируемый раствор белка. Контролем служил раствор, полученный из фрагмента геля, не содержащего белка. Интервал детектируемых масс составлял 4000-100000 Да. Масс-спектромет-рия проводилась в режиме положительных ионов.

2. Результаты исследования

При росте бактерий Б.евИ на питательной среде вокруг фильтров, пропитанных гемолимфой, наблюдали зону отсутствия роста (отсутствие колоний) и зону ограниченного роста (наличие единичных точечных колоний). Исследование антибактериальной активности показало, что гемолимфа иммунизированных личинок обладает выраженной антибактериальной активностью, что обнаруживается по достоверному увеличению ширины зон задержки роста Б.евИ по сравнению с контрольными фильтрами, пропитанными буферным раствором (табл. 1).

Таблица 1

Значения зон задержки роста Е.соИ на плотной среде вокруг дисков, пропитанных раствором гемолимфы

Проба Зона ограничения роста, мм Зона отсутствия роста, мм Достоверность различий (к контролю)

Гемолимфа иммунизированных личинок 10,10±0,53 6,9±0,06 P < 0,01

Контроль (0,1 М фосфатный буфер рН 7,2) 5,0 ± 0,80

С целью выделения и очистки антибактериальных компонентов была проведена ионообменная хроматография гемолимфы иммунизированных личинок Galleria Mellonella, а также экстракта личинок, лишенных гемолимфы.

В случае фракционирования гемолимфы было собрано 17 фракций по 2,5 мл (рис. 1, 2), а фракционирования экстракта личинок —12 фракций по 2,5 мл (рис. 3, 4).

Рис. 1. Ионообменная хроматография гемолимфы личинок Galleria Mellonella на колонке (15×0,7 см) с сефадексом СМ-50

В процессе ионообменной хроматографии произошло разделение гемолимфы на две белковые фракции: высокомолекулярную (молекулярная масса выше 200000 Да) и среднемолекулярную (молекулярная масса ниже 200000 Да).

Данные хроматографического анализа экстракта личинок Galleria Mellonella лишенных гемолимфы, представлены на рис. 3 и 4.

Как видно из хроматограмм, в процессе ионообменной хроматографии не произошло удовлетворительное разделение белков.

Рис. 2. Содержание белка во фракциях гемолимфы личинок Galleria Mellonella

Объем элюента, мл

Рис. 3. Ионообменная хроматография белков, полученных из экстракта личинок Galleria Mellonella, лишенных гемолимфы, на колонке с сефадексом СМ-50 (15×0,7 см)

2.1. Микробиологическое тестирование на наличие антибактериальной активности у фракций гемолимфы

Для проведения микробиологического тестирования было отобрано пять фракций гемолимфы, обладающих концентрацией белка, превышающей 0,7 мг/мл.

Получены достоверные расширения зон задержки роста E.coli в белковых фракциях гемолимфы. (табл. 2) На основании этого сделано предположение о наличии в данных фракциях компонентов, обладающих бактериостатическим действием.

По результатам микробиологического тестирования установлено, что фракция № 3, обладающая наименьшей концентрацией белка из выбранных фракций, имеет высокую антибактериальную активность. Данная фракция при микробиологическом тестировании давала три четко различающиеся концентрические зоны: зону полного отсутствия роста (1), зону мелких колоний (уменьшение скоростироста), зону единичных, но более крупных колоний (3). Вероятно, наличие нескольких

Номер фракции

Рис. 4. Содержание белка во фракциях, полученных из экстракта личинок Galleria Mellonella, лишенных гемолимфы

зон связано с многокомпонентностью данной фракции, обнаруженной в дальнейших экспериментах.

Выявлено, что 2 фракции гемолимфы (№7 и №8), имеющие самые высокие концентрации белка, не обладают антибактериальной активностью.

Таблица 2

Значения зон задержки роста Е.соИ на плотной среде вокруг дисков, пропитанных фракциями гемолимфы

№ фракции Зона ограничения роста, мм Достоверность различий (к контролю)

3 Первая зона: 7,10 ± 0,01 Зона мелких колоний в виде кольца: 8,20 ± 0,30 Вторая зона: 13, 5 ± 0,77 P < 0,01

6 7,58 ± 0,38 P < 0,01

7 6,00 ± 0,00

8 6,00 ± 0,00

9 7,00 ± 0,33 P < 0,05

Контроль (0,15 М цитрат-фосфатный буфер рН 5,1) 6,00 ± 0,00

2.2. Гель-электрофорез

С целью анализа биологически активных белков и очистки антибактериальных компонентов проведен гель-электрофорез гемолимфы иммунизированных личинок, а также растворенного в 0,5 мл 0,1 м фосфатного буфера рН 7,2 осадка гемолимфы иммунизированных личинок и двух фракций гемолимфы иммунизированных личинок (№ 3 и № 6), обладающих по результатам микробиологического тестирования наибольшей антибактериальной активностью (рис. 5).

Рис. 5. Электрофореграммы двух фракций гемолимфы иммунизированных личинок: № 3 (А) и № 6 и электрофореграммы раствора гемолимфы иммунизированных личинок (В) и осадка гемолимфы (Г) иммунизированных личинок. На всех электрофореграммах белки расположены в порядке уменьшения их молекулярных масс

На электрофореграммах фракции № 3 отчетливо видны 2 белковые полосы. На электрофореграммах фракции № 6 видна 1 белковая полоса. Установлено, что фракция № 6, обладающая средней антибактериальной активностью, содержит один белковый компонент, а фракция № 3, обладающая наименьшей концентрацией белка и имеющая высокую антибактериальную активность содержит, два белковых компонента (рис. 5).

ны области 5 белковых полос: первые три белковые полосы выражены слабо, две следующие — ярко.

На электрофореграммах осадка гемолимфы иммунизированных личинок белки расположены неравномерно, это значит, что в процессе электрофореза данные белки частично или полностью гидролизовались.

В качестве белка-маркера был использован трипсин (23500 Да). Можно предположить, что массы большинства обнаруженных белков либо сравнимы с молекулярной массой трипсина в пределах погрешности эксперимента, либо ниже этой массы.

Относительную электрофоретическую подвижность (Иш) обнаруженных белковых полос (табл. 3) рассчитывали по формуле:

Расстояние, пройденное зоной белка Яш =————————————-.

Длина электрофореграммы

Таблица 3

Среднее значение электрофоретической подвижности исследуемых

белков

Проба Количество полос Среднее значение Иш

Фракция № 3 2 0,78915 0,85540

Фракция № 6 1 0,80952

Осадок гемолимфы иммунизированных личинок 2 0,4408 0,4838

Гемолимфа иммунизированных личинок без осадка 5 0,1304 0,2391 0,3043 0,5333-0,5869 0,9347-0,9565

Трипсин 1 0,5189

2.2.1. Масс-спектрометрия

После избирательной элюции разделенных электофорезом белков из геля полученные растворы белков анализировали методом матричной лазерной десорб-ционной ионизации МЛДИ (рис: 6, а-е) Контролем служил раствор, полученный также из фрагмента геля, не содержащего белка (рис. 7).

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Масс-спектрометрический анализ показал наличие в каждом из полученных растворов белкового компонента с молекулярной массой 5627 (5633) Да. Это значит, что в данных условиях в процессе электрофореза не произошло корректного фракционирования белков, имеющих указанный диапазон масс.

Присутствие указанного белкового компонента в осадке гемолимфы, вероятно, вызвано механическим захватом или иным взаимодействием, произошедшим в процессе осаждения или отделения осадка от гемолимфы, и, возможно, обусловливает антибактериальную активность осадка гемолимфы иммунизированных личинок (табл. 4).

Многочисленные осколочные ионы невысокой интенсивности на масс-спектрах осадка гемолимфы неинформативны и, возможно, обусловлены фрагментацией белков осадка с молекулярной массой выше 90000 Да (рис. 6 а, б).

Масс-спектр нижнего белка с электрофореграммы гемолимфы иммунизированных личинок позволил оценить его молекулярную массу, которая составила 5627 Да. Данный белок проявляет антибактериальные свойства, поскольку достоверно увеличивает размеры зоны задержки роста Б.еоИ (табл. 4).

Рис. 6 а. Масс-спектр белка Г1 осадка гемолимфы иммунизированных личинок

Немногочисленные осколочные ионы невысокой интенсивности на масс-спектре центрального белка, возможно, обусловлены наличием высокомолекулярного белка, пик молекулярного иона которого находится за пределами области детектирования. Антибактериальная активность данной фракции, вероятно, обусловлена либо присутствием белкового компонента с молекулярной массой 5627 (5633) Да, либо наличием указанного высокомолекулярного белка.

Шеш.

ХІ08 6 ^

5627

4 —

7975

5000 6000 7000 8000 9000 т!г

Рис. 6 в. Масс-спектр белка В2 из гемолимфы иммунизированных личинок

ьиепв. 4 хЮ9

1,0 0,8

0,6

0,4

0,2

5656

Т—1—1—1——————1-1-1-1-1—-1-1-1-1-1——1-1-1-1-1——1-1-1-1-1——1-1-1-1-1——-1-1-1-1-Г»

5000 5500 6000 6500 7000 7500

т/г

Масс-спектр белка фракции № 6 позволил оценить его молекулярную массу, которая составила 5628 Да. Данный белок также проявляет антибактериальные свойства, так как достоверно увеличивает размеры зоны задержки роста Б.еоИ (табл. 4).

Масс-спектрометрический анализ фракции № 6 и белков гемолимфы иммунизированных личинок выявил единую природу антибактериальных белковых компонентов из гемолимфы иммунизированных личинок, полученных разными способами.

Intens. f

xio’

1,5

1,0

0,5

5652

0,0

5000 6000 7000 8000

Рис. 6 д. Масс-спектр белка из фракции № 6 (Б)

L-plp ,.|ЦЧу1„к .Jy _

9000 m/z

Рис. 6 ж. Масс-спектр двух белковых компонентов фракции № 3 (А] и А2)

Многочисленные пики на данном масс-спектре (рис. 6, ж) мало информативны. Высокая антибактериальная активность данной фракции, возможно, обусловлена неисследованными белковыми компонентами с молекулярной массой, превышающей предел детектирования 100000 Да. Это согласуется с данными проведенной нами ионообменной гель-хроматографии.

Масс-спектрометрический анализ раствора, полученного из фрагмента геля, не содержащего белка, позволил оценить фоновый уровень шумов, возникающих при снятии масс-спектров белков, элюированных с фрагментов гомогенизированного геля.

Проведение микробиологического тестирования растворов белка, экстрагированных из геля, показало достоверное увеличение зон ограничения или полного отсутствия роста Б.еоИ (табл. 4).

Рис. 7. Масс-спектр раствора, полученного из фрагмента геля, не содержащего белка (контроль)

В конце 1970 гг. был проведен ряд биохимических исследований на иммунизированных насекомых, которые закончились выделением новых классов антибактериальных пептидов, названных цекропины [13] и др. В настоящее время гемолимфа насекомого считается одним из самых богатых источников новых антибактериальные агентов; число новых индуцированных антибактериальных пептидов из насекомых превышает 150 [15].

В 1980 году в гемолимфе иммунизированных личинок Galleria mellonella обнаружены 4 неспецифических бактериолизина, представляющих собой основные белки, обладающие лизоцим- и цекропинподобной активностью [15-19]. В 2001 году были выделены, биохимически охарактеризованы и названы два индуцированных антимикробных пептида из гемолимфы иммунизированных личинок Galleria Mellonella. Показано, что один пептид принадлежит к классу цекропинов, а второй богат остатками пролина и, возможно, является членом нового класса антибактериальных пептидов [20].

Таблица 4

Значения зон задержки роста E.coli на плотной среде вокруг дисков, пропитанных растворами разделенных электрофорезом белков из гемолимфы иммунизированных личинок Galleria mellonella

Проба Зона ограничения роста, мм Зона отсутствия роста, мм Достоверность различий (к контролю)*

Белок 1 из осадка гемолимфы (верхний белок) 8,71 ± 0,22* 6,00 ± 0,00 P < 0,01*

Белок 2 из осадка гемолимфы (нижний белок) 7,89 ± 0,15 7,75 ± 0,20* P < 0,01*

Белок 1 из раствора гемолимфы (нижний белок) 8,14 ± 0,18* 6,00 ± 0,00 P < 0,01*

Белок 2 из раствора гемолимфы (центральный белок) 8,07 ± 0,18* 6,00 ± 0,00 P < 0,01*

Фракция № 6 8,13 ± 0,15 6,50 ± 0,10 P < 0,01

Контроль 6,02 ± 0,80 6,00 ± 0,00

Настоящая работа описывает обнаружение и выделение неизвестных белковых компонентов из гемолимфы иммунизированных личинок Galleria mellonella, обладающих (специфической) антибактериальной активностью, выявляемой по увеличению размеров зон ограничения роста бактерии Е. coli.

В работе были обнаружены и выделены белковые компоненты, обладающие значительной антибактериальной активностью, и которые в дальнейшем могут быть использованы для лечения бактериальных инфекций.

Полученные данные позволяют обосновать целесообразность применения препаратов, полученных из личинок Galleria Mellonella в медицине, гомеопатии и терапевтической практике.

Масс-спектрометрический анализ показал присутствие в гемолимфе личинок Galleria mellonella антибактериального пептида с молекулярной массой 5627 Да, который в дальнейшем предполагается очистить и охарактеризовать.

Литература

[1] Prevention of restenosis using the gene for cecropin complexed with DOCSPER liposomes under optimized conditions / S.Nikol [et. al.] // Int. J. Angiol. -2000. — V. 9. — №2. — Р. 87-94.

[2] Characterisation of antibacterial activity of peptides isolated from the fenomen of the spider Cupiennius salei (Araneae: Ctenidae) / S.Haeberli [et. al.] // Toxicon. — 2000. — V. 38. — № 3. — Р. 373-380.

[3] Sawa, T. Antimicrobal peptides/proteins — application to the therapy of sepsis / T.Sawa, K. Kurahashi // Masui. — 1999. — V. 48. — №11. — Р. 1186-1193.

[4] Спиридонов, Н.А. Сердечнососудистый препарат из восковой моли / Н.А. Спиридонов, А.К. Рачков , М.Н. Кондрашова // Пчеловодство. — 1993. -№4. — С. 5-8.

[5] Spiridonov, N.A. On chemical composition of a biologically active preparation from Galleria mellonella / N.A. Spiridonov, E.V. Kashparova, B.P. Baskunov // Comp. Biochem. Physiol. — 1992. — Р. 109.

[6] Rachkov, A.K. Adaptogenic and cardioprotective action Galleria mellonella extract in rats and frogs / A.K. Rachkov, N.A. Spiridonov, M.N. Kondrashova // J. Pharm. Pharmacol. — 1994. — №46. — Р. 221.

[7] Antioxidannt and immunoprotective properties of the ancient remedy of folk medicine from Galleria Mellonella / E.G. Litvinova [et. al.] // Intern. Symposium ’’Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Diagnostic, Preventive and Therapeutic Values” St.Petersburg-Kizhi. — SPb., 2002. — Р. 126.

[8] Натуральный экстракт доктора Мухина — биологически активная добавка из личинок восковой мoли с лечебным и профилактическим действием при бронхо-легочных заболеваниях: иммуномодулирующая и антибактериальная активность, лечебное действие / Е.Г. Литвинова [и др.] // Х Международный Съезд ФИТОФАРМ 2006 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения”. — СПб., 2006. — С. 219-223.

[9] Обнаружение и выделение антибактериальных пептидов из экстрактов личинок Galleria mellonella / П.П.Пурыгин [и др.] // Вестник Самарского госу-ниверситета. Естественнонаучная серия. — 2006. — №6/1(46). — С. 201-211.

[10] Stephens, J.M. Bactericidal activity of the blood actively immunized wax moth larvae / J.M. Stephens // Can. J. Microbiol. — 1962. — №8. — Р. 597-602.

[11] Досон, Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот; под ред. К. Джонса. — М.: Мир, 1991. — С. 544.

[12] Фролов, Ю.П. Математические методы в биологии. ЭВМ и программирование: теоретические основы и практикум / Ю.П. Фролов. — Самара: Изд-во СамГУ, 1997. — С. 265.

[13] Hoffmann, D. Insect immunity: Galleria mellonella and other lepidoptera have cecropiaP9-like Factors active against Gram negative bacteria / D. Hoffmann, D. Hultmark, H.G. Boman // Insect Biochem. — 1981. — V. 11. — Р. 537-548.

[14] Isolation from the lepidopteran heliohtis vireskins of a novel insekt defensin with potent antifungal activity / M.Lamberty [et. al.] // J. of biological chemistry. -1998. — V. 274. — №14. — Р. 9320-9326.

[15] Powning, R.F. Studies on insect bacteriolytic enzymes — 1. Lysozyme in haemolymph of Galleria mellonella and Bombex mory / R.F. Powning, W.J. Davidson // Comp. Biochem. Phisiol. — 1972. — V. 45B. — Р. 669-686.

[16] Jarosz, J. Active resistance of entomophagous rhabditid Heterorarhabditix bacteriophora to insect immunity / J. Jarosz // Parasitology. — 1998. — V. 117. -№ 3. — Р. 201-208.

[17] Jarosz, J. Simultaneous induction of protective immunity and selective Synthesis of hemolymph lysozyme protein in larvae of Galleria mellonella / J. Jarosz // Biol. Zbl. — 1979. — V. 98. — Р. 459-471.

[18] Phipps, D.J. Gallysin-1, an antibacterial protein isolated from hemolymph of Galleria mellonella / D.J. Phipps // Dev. Comp. Immunol. — 1994. — V. 18. -№ 1. — Р. 13-23.

[19] Virulence of Candida albicans mytants toward larval Galleria mellonella (Insecta, Lepidoptera, Galleridae) / M. Whiteway [et. al.] // Can. J. Microbiol. — 2003. -V. 49. — №8. — Р. 514-524.

[20] Mak, Р. Antibacterial peptides of the moth Galleria mellonella / Р. Mak,

D. Chmiel, G.J. Gacek // J. Acta Biochimica Polonica. — 2001. — №4. -Р. 1191-1195.

Поступила в редакцию 13/XII/2006; в окончательном варианте — 13/XII/2006.

EXCRETING ANTIBACTERIAL COMPONENTS FROM HEMOLYMPH OF LARVAE OF GALLERIA MELLONELLA

© 2007 P.P. Purygin, O.S. Sribnajaf N.A. Klenova, D.N. Khudyakovaf

E.G. Litvinova, M.N. Kondrashova, А.А. Ovsepjan6

This work deals with the antibacterial activity of hemolymph of immunized larvae of Galleria Mellonella. There are protein fractions with antibacterial activity excreted with the help of ion-exchange chromatography and gel-electrophoresis from hemolymph. The mass-spectrometric analysis of fractions showed the presence of peptide with the mass of 5627 Da. Probably, this peptide determines the antibacterial activity of hemolymph.

Paper received 13/X///2006. Paper accepted 13/X///2006.

4Purygin Pyotr Petrovich (purygin2002amail.ru), Sribnaja Olesya Sergeevna, Dept. of Organic Chemistry, Samara State University, Samara, 443011, Russia.

5 Klenova Natalia Anatolevna, Khudyakova Darya Nikolaevna, Dept. of Biochemistry, Samara State university, Samara, 443011, Russia.

6 Litvinova Elena Gennadevna, Kondrashova Maria Nikolaevna, Ovsepjan Armen Aleksandrovich, Laboratory of Metabolic Biochemistry, Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Science, Puschino, 142290, Ruassia.

В последние годы в качестве альтернативной модели для изучения бактериальных инфекций, а также для оценки эффективности антибактериальных препаратов широко используют Galleria mellonella — личинки большой восковой моли. Преимущества данной модельной системы — отсутствие биоэтических ограничений, возможности использования большого количества животных в эксперименте, короткий жизненный цикл. Личинки могут расти при широком температурном диапазоне (18–37 °C), что позволяет исследовать на данной модели патогены человека, которым в большинстве случаев необходима инкубация при 37 °C. Несмотря на отсутствие у насекомых приобретенного иммунитета, врожденный иммунитет восковой моли имеет значительное сходство с иммунным ответом позвоночных животных, в том числе и человека.

Цель работы — разработка модели бактериальной инфекции личинок большой восковой моли, включающая сравнительную оценку как эффективности заражения личинок эталонными штаммами микроорганизмов и их клиническими изолятами, так и применения препаратов Рифампицин (ПАО «Красфарма», Россия) и Ципрофлоксацин (Эльфа Лабораториз, Индия) на инфицированных личинках.

Данное исследование предусматривало три последовательных этапа, на I этапе проводили сравнительную оценку вирулентности эталонных штаммов Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli и их клинических изолятов, а также определяли инфекционную дозу бактериальной суспензии для инъекции личинкам. Таким образом, было установлено, что исследуемые клинические изоляты St. aureus, Str. pneumoniae и E. coli оказались более вирулентными относительно эталонных штаммов микроорганизмов.

На II этапе исследования определяли минимально подавляющую концентрацию in vitro для каждого штамма микроорганизма, что позволяло определить чувствительность штаммов к исследуемым антибиотикам, а именно ципрофлоксацину и рифампицину.

На III этапе после заражения личинок инфекционной дозой была проведена антибактериальная терапия, при этом полученные результаты подтвердили данные II этапа in vitro. Наблюдали гибель личинок, зараженных резистентными штаммами St. aureus и E. coli к ципрофлоксацину и рифампицину соответственно.

Данная модель характеризовалась изменением общего состояния личинок (меланизация, подвижность, образование кокона) и гибелью животных в зависимости от концентрации микроорганизмов в инокулюме. Продемонстрировано, на сколько данная модель применима для оценки чувствительности бактерий к антибиотикам на примере ципрофлоксацина и рифампицина.

Введение

Доклинические исследования эффективности и безопасности лекарственных средств проводят с использованием лабораторных животных, обеспечивающих возможность переносить полученные результаты на человека. В качестве таких тест-систем наиболее часто используют грызунов — мышей, крыс. Однако при проведении исследований на животных необходимо учитывать этические принципы и большую стоимость данных разработок.

Помимо стандартных моделей исследований с применением лабораторных грызунов существуют альтернативные модели, использующие в качестве тест-системы беспозвоночных животных. Данные модели не могут полностью заменить исследования на млекопитающих, но они применяются в качестве дополнительных для расширения знаний о бактериальном патогенезе, изучения вирулентности микроорганизмов, а также открытия новых антибактериальных соединений.

Для изучения бактериальных инфекций, а также для оценки эффективности антибактериальных препаратов широко используются личинки большой восковой моли [1]. Большая восковая моль Galleria mellonella — один из традиционных объектов лабораторных исследований [2]. Отсутствие биоэтических ограничений и возможность применения большого количества личинок в эксперименте позволяют большой восковой моли быть модельным объектом в следующих тестах:
1) определение микробной вирулентности и патогенности микроорганизмов;
2) определение ЛД₅₀ (среднелетальная доза) вещества;
3) фармакокинетика;
4) тестирование эффективности противомик­робных средств на зараженных личинках.

Несмотря на отсутствие у насекомых приобретенного иммунитета, врожденный иммунитет восковой моли имеет значительное сходство с иммунным ответом позвоночных животных, в том числе и человека [3]. Эти характеристики делают G. mellonella удобным объектом для оценки вирулентности бактерий, а также исследований на чувствительность к антибиотикам, в частности, штаммов Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae и Escherichia coli [4, 5].

Цель данного исследования — разработка модели бактериальной инфекции личинок большой восковой моли, включающая сравнительную оценку эффективности не только заражения личинок эталонными штаммами микроорганизмов и их клиническими изолятами, но и применения препаратов Рифампицин (ПАО «Красфарма», Россия) и Ципрофлоксацин (Эльфа Лабораториз, Индия) на инфицированных личинках.

Материал и методы

Личинки большой восковой моли

В качестве биологической тест-системы использовали личинки большой восковой моли G. mellonella. В исследование отбирали личинки в возрасте 5 нед, массой 200–300 мг. Личинки большой восковой моли до начала эксперимента содержали на искусственном субстрате (22% кукурузной муки, 22% зародышей пшеницы, 11% сухих дрожжей, 17,5% пчелиного воска, 11% меда и 11% глицерина) при температуре 2–8 °C в затемненных контейнерах для замедления созревания и перехода в стадию куколки [6]. После заражения личинки помещали в чашках Петри без субстрата, затем — в термостат при температуре 37 °C на 5 сут [7]. Распределение животных на группы по 10 личинок в каждой проводили методом слепой рандомизации [8]. Исследование выполняли в соответствии с принципами 3Rs, то есть осуществили замену лабораторных животных на альтернативную модель более низкой филогенетической группы. Проведение исследования было одобрено экспертной комиссией (ЭК) АО НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ» (протокол ЭК № 8/21).

Микроорганизмы

В качестве инфекционных агентов были выбраны эталонные штаммы микроорганизмов из Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, ATCC): E. coli ATCC 25922 (ВКПМ В-8076), St. aureus ATCC 29213, Str. pneumoniaе ATCC 6303, а также их клинические изоляты: E. coli ENV 194, St. aureus SA 0077 (MRSA), Str. pneumoniaе 1068 19 А. Музейные тест-штаммы и клинические изоляты, используемые в исследовании перед началом эксперимента, были активированы высевом в гидролизат говяжьего мяса ферментативного (ГМФ-бульон) с последующим пересевом на соответствующий питательный агар: ГМФ-агар, колумбийский агар.

Определение инфекционной дозы

Заражение штаммами E. coli, Str. pneumoniaе, St. aureus проводили в 1‑й день эксперимента путем введения бактериального инокулюма в гемоцель через последнюю левую ложноножку с помощью микрошприца Hamilton (Hamilton, СШA) 10 мкл [9]. Для удобства введения инокулюма личинки были обездвижены путем помещения на 15 мин в холодильную камеру при температуре 2–8 °С. Для создания оптимальных условий развития патогена после заражения личинки содержали в термостате при температуре 37 °C [6, 9]. Инфекционная доза определялась как доза, вызывающая иммунный ответ, распознаваемый по потемнению кутикулы, а также 60–80% летальность [9].

Регистрация показателей здоровья личинок

Для оценки заражения штаммами микроорганизмов проводили учет показателей здоровья личинок (в соответствии с табл. 1 и рис. 1). Было оценено состояние здоровья личинок путем присвоения баллов по 4 основным показателям: подвижность личинок, образование коконов, меланизация и выживаемость [7]. При оценке подвижности личинки использовали в качестве стимула стерильные одноразовые петли.

Личинки признавали мертвыми, если они не проявляли реакции (движений) на прикосновение. Оценку выживаемости проводили методом построения кривой Каплана–Мейера. Летальность и учет показателей здоровья личинок оценивали каждые 24 ч [6, 7, 10, 11].

Определение антимикробной активности in vitro

На данном этапе исследования определяли чувствительность используемых штаммов микроорганизмов к рифампицину и ципрофлоксацину in vitro для дальнейшего исследования эффективности лечения данными препаратами инфицированных личинок. Определение антимикробной активности исследуемых объектов проводили методом микроразведений в планшетах с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК). Для метода микроразведений грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов использовали бульон Мюллера–Хинтона [12], для микроорганизма Str. pneumoniae — бульон Мюллера–Хинтона с добавлением 5% лизированной бараньей крови [13, 14].

На данном этапе изучали тестируемые объекты ципрофлоксацин и рифампицин. Рифампицин активен в отношении грамположительных микроорганизмов Streptococcus spp. и Staphylococcus spp., а также является стандартным средством лечения метициллинрезистентного стафилококка (S. aureus MRSA). Однако по отношению к грамотрицательным микроорганизмам E. coli рифампицин менее активен. К ципрофлоксацину чувствительны грамотрицательные аэробные микроорганизмы E. coli, также он активен в отношении грамположительных микроорганизмов Streptococcus spp. и Staphylococcus spp. Однако большинство стафилококков, устойчивых к метициллину (S. aureus MRSA), резистентны к ципрофлоксацину [15, 16].

Приготовление рабочих растворов исследуемых объектов осуществляли с использованием бульона Мюллера–Хинтона. Были изучены концентрации от 0,007 до 512 мкг/мл. Планшеты инкубировали при температуре 34–37 °С в течение 18±2 ч [12]. После инкубации визуально оценивали наличие или отсутствие роста микроорганизмов в лунках планшетов. МПК исследуемых объектов соответствовала лунка с наименьшей концентрацией исследуемых объектов без признаков видимого роста тест-микроорганизмов.

Антибактериальная терапия инфицированных личинок

Личинок большой восковой моли заражали инфекционной дозой, установленной на I этапе эксперимента в последнюю левую ложноножку, затем инкубировали в термостате при температуре 37 °C. Через 2 ч вводили тестируемые препараты в последнюю правую ложноножку и продолжали инкубацию.

Согласно инструкции по медицинскому применению (ИМП) препарата Рифампицин в виде лиофилизата для приготовления раствора для инфузий (150 мг) [15], максимальная суточная доза 600 мг, что при пересчете на 1 кг массы тела взрослого человека составляет:

Терапевтическая доза = 600 мг/60 кг (средняя масса тела человека) = 10 мг/кг.

Терапевтическая доза (ТД) ципрофлоксацина, согласно инструкции по медицинскому применению, также равна 10 мг/кг [16].

Расчет концентрации (С) инъекции антибиотика проводили по формуле:

C_{инъекции} = (C_in vivo×V_{личинки})/V_{инъекции},

где C_{инъекции} — концентрация тестируемого объекта в инъекции; C_in vivo — концентрация тестируемого объекта в личинке; V_{личинки} — объем личинки, V_{личинки}=0,3 мл; V_{инъекции} — объем инъекции, V_{инъекции}=10 мкл.

При перерасчете концентрации ципрофлоксацина на личинку с учетом отношения массы гемолимфы личинки к ее объему, приблизительно равному единице [17], соответствует:

10 мг/кг = 10 мкг/г = 10 мкг/мл = C_in vivo.

Концентрация вводимого препарата для личинки:

C_{инъекции} = (10 мкг/мл×0,3 мл)/0,01 мл = 300 мкг/мл.

Таким образом, было исследовано 3 дозы: 1/2 ТД; ТД; ТД×2.

В каждой исследуемой группе было по 10 личинок, причем в каждый первый день использовали 3 контрольные группы: интактную, травмированного контроля (нарушение целостности кутикулы, прокалывание иглой) и контрольную с введенным буфером (PBS). Также были добавлены контрольные группы для тестируемых препаратов, чтобы исключить токсическое влияние самих антибиотиков. На протяжении всего III этапа осуществляли регистрацию гибели ежедневно с балльной системой учета показателей здоровья (см. табл. 1).

Эвтаназия

Эвтаназию всех использованных в эксперименте личинок большой восковой моли проводили путем погружения в 70% раствор этилового спирта в последний, 5‑й день эксперимента [18].

Анализ данных

Для данных, полученных на I этапе исследования, был применен анализ выживаемости методом Каплана–Мейера с последующей оценкой межгрупповых различий логранговым тестом Мантела–Кокса с построением кривой выживаемости.

Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05. Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения Prism 9 (GraphPad Software, СШA).

Расчет летальных доз (ЛД₅₀ и ЛД₇₀) проводили с помощью пробит-анализа по Прозоровскому [19].

Результаты и обсуждение

I этап — моделирование патологии

На протяжении всего эксперимента (до заражения, в 1‑й день и далее каждые 24 ч до эвтаназии) проводили учет показателей здоровья личинок (см. табл. 1).

До заражения у личинок всех экспериментальных групп наблюдали активное движение и способность к коконообразованию, меланизация отсутствовала.

При учете показателей здоровья через 24 часа после контрольного укола и введения индукторов патологии в интактной группе не установлено признаков угнетения личинок. Все личинки проявляли умеренную активность с возможностью коконообразования. Меланизация и гибель отсутствовали (рис. 2).

Во всех группах с нарушением целостности покровов регистрировали единичные случаи гибели личинок. В группах с контрольным проколом и с введенным фосфатно-солевым буфером регистрировали гибель одной личинки в каждой группе. Оставшиеся в живых личинки не отличались по своим жизненным показателям от интактных (рис. 3).

В группах, зараженных инокулюмом в более низких концентрациях, наблюдали гибель нескольких личинок (рис. 4). Выжившие личинки были в основном активны, меланизация либо отсутствовала, либо была слабо выражена, способность к коконообразованию сохранилась. С увеличением концентрации инокулюма, смертность в группах значительно возрастала (рис. 5, 6). У оставшихся в живых личинок регистрировали снижение активности, потемнение кутикулы и угнетение способности коконообразования (см. рис. 4). У погибших личинок отмечали полное почернение покровов тела (рис. 7).

Для оценки вирулентности штаммов было принято решение рассчитать летальные дозы с использованием пробит-анализа по Прозоровскому (табл. 2).

Исходя из полученных значений ЛД₅₀, можно сделать заключение, что клинические изоляты являются более вирулентными относительно соответствующих эталонных штаммов.

Для заражения и дальнейшего лечения личинок большой восковой моли была установлена инфекционная доза. За инфекционную дозу бактерий приняли дозу, вызывающую 60–80% летальность. Исходя из расчетов летальной дозы (ЛД₇₀), были выбраны дозы для инфицирования и дальнейшей антибактериальной терапии личинок на III этапе исследования.

II этап — определение МПК

Через 18 ч после инкубации планшетов оценивали антимикробную активность рифампицина и ципрофлоксацина в отношении используемых штаммов микроорганизмов. Для подтверждения вносимого количества клеток микроорганизмов в лунки планшетов в день постановки теста проводили высев содержимого лунки на чашки Петри. Контроль посевной дозы подтвердил необходимое количество клеток, вносимых в лунки планшетов, для бактерий в диапазоне 2×10⁵–8×10⁵ КОЕ/мл [13].

Также вместе с контролями посевных доз проводили учет результатов с 96‑луночных планшетов. Результаты учитывали визуально в проходящем свете. Данные оценки антимикробной активности сравнивали со значениями ECOFF (Epidemiological cut-off value, эпидемиологическое пороговое значение), представленными EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Европейский комитет по тестированию чувствительности к антимикробным препаратам), полученные сведения отображены в табл. 3.

При сравнении полученных значений МПК и ECOFF можно сделать выводы о чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

Клинический изолят S. aureus SA0077 по паспорту является метициллинрезистентным золотистым стафилококком (MRSA) соответственно, штамм оказался устойчивым к ципрофлоксацину и чувствительным к рифампицину. Эталонный штамм S. aureus ATCC 29213 также чувствителен к рифампицину и начал вырабатывать устойчивость к ципрофлоксацину. Str. pneumoniae, эталонный штамм и клинический изолят оказались оба чувствительными к исследуемым антибиотикам. E. coli, как и ожидалось, был чувствителен к ципрофлоксацину и устойчив к рифампицину.

III этап — антибактериальная терапия

На III этапе исследования проверяли работу антибиотиков in vivo, заражали личинок большой восковой моли инфекционной дозой, а затем осуществляли антибактериальную терапию. При этом, как и на I этапе, проводили учет показателей здоровья личинок до заражения, в 1‑й день и далее каждые 24 ч. До заражения все личинки были активны и способны к коконообразованию, меланизация отсутствовала.

В 1‑й день эксперимента заражали личинок большой восковой моли соответствующими инфекционными дозами для каждого исследуемого штамма. Расчетные и фактически полученные концентрации инокулюмов представлены в табл. 4.

Концентрация инокулюма у штаммов Str. pneumoniae ATCC 6303, Str. pneumoniae 1068 19A, E. coli ENV 194 превысила расчетные концентрации на порядок, однако антибактериальная терапия все же оказалась эффективной относительно негативного контроля — инфицированных личинок без лечения.

При учете показателей здоровья через 24 ч после контрольного укола и введения индукторов патологии в контрольных группах не установлено признаков угнетения личинок. Все личинки проявляли умеренную активность с возможностью коконообразования. Меланизация и гибель отсутствовали, за исключением гибели одной личинки в группе контрольного прокола. Сумма баллов при оценке показателей здоровья в течение 5 дней наблюдения не была ниже 87,5. Также в группах контроля токсичности антибиотика гибель не зарегистрирована, личинки чувствовали себя хорошо — сумма баллов здоровья не ниже 91 из 100. В негативном контроле (зараженные личинки без лечения) регистрировали значительную гибель, потемнение кутикулы и снижение активности.

Как и ожидалось по результатам исследования in vitro, ципрофлоксацин оказался неэффективным, а рифампицин был действенным во всех концентрациях относительно микроорганизма St. aureus. Рифампицин in vivo чуть лучше воздействовал на инфекцию, вызванную эталонным штаммом St. aureus ATCC 29213, чем клиническим изолятом SA 0077. Оценка (в баллах) здоровья личинок, получавших антибактериальную терапию рифампицином, была значительно выше, чем в негативном контроле, что подтверждает действие антибиотика по отношению к штамму St. aureus SA 0077 (рис. 8).

Штаммы Str. pneumoniae оказались чувствительны по отношению к исследуемым антибиотикам во всех концентрациях. Установлено, что на уровень здоровья личинок эталонный штамм Str. pneumoniae ATCC 6303 и клинический изолят Str. pneumoniae 1068 19A влияли одинаково (рис. 9).

Из II этапа следует, что штамм E. coli устойчив по отношению к рифампмцину, что можно увидеть на графике при оценке уровня здоровья (рис. 10), однако к ципрофлоксацину E. coli был чувствителен во всех концентрациях.

Таким образом, антибактериальная терапия во всех трех исследуемых дозах, рассчитанных исходя из терапевтических, оказалась эффективной. Как и ожидалось, in vivo наблюдали резистентность S. aureus по отношению к ципрофлоксацину, E. coli — к рифампицину.

Заключение

В рамках проведенного эксперимента была разработана модель бактериальной инфекции личинок Galleria mellonella на примере эталонных штаммов Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae и их клинических изолятов. Модель характеризовалась изменением общего состояния личинок (меланизация, подвижность, образование кокона) и гибелью животных в зависимости от дозы микроорганизмов.

Было установлено, что исследуемые клинические изоляты Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae и Escherichia coli оказались более вирулентными относительно эталонных штаммов микроорганизмов при инфицировании личинок Galleria mellonella. Штаммы микроорганизмов, оказавшиеся резистентными к антибиотикам в исследовании in vitro, приводили к гибели личинок на фоне антибактериальной терапии теми же антибиотиками.

Таким образом, совокупность полученных результатов продемонстрировала применимость в качестве модельного объекта личинок Galleria mellonella для оценки эффективности антибактериальных препаратов.