Инструкция по приготовлению питательных сред

Техника приготовления основных питательных сред

Для культивирования микробов в
лабораторных усло­виях готовят
питательные среды с учетом потребности
в питательных веществах каждого вида
в отдельности. Питательная среда в своем
составе должна содержать углерод,
водород, кислород, азот, фосфор, серу,
магний, железо, микроэлементы и
биостимуляторы роста.

Различают питательные среды естественные(молоко, яйца, картофель и т. п.),искусственные,приготовленные из
продуктов животного или раститель­ного
происхождения, исинтетические(среды Чапека, Сабуро). По консистенции
среды могут быть жидкими, полужидкими
и плотными.

Для приготовления плотных сред в жидкие
среды добавляют агар-агар или желатин.
Агар-агар представляет собой продукт
переработки высушенных морских водорослей
рода анфельция, состоящий в основном
из полисахаридов. В холодной воде
агар-агар набухает и размягчается, в
горячей (90—100° С) расплавляется, образуя
клееобразную массу. Застывает агар-агар
при 40° С, образуя студень. Как питательное
вещество агар-агар микробами не
используется.

Желатин получают путем вываривания
кожи, костей и сухожилий животных. При
нагревании с водой желатин образует
коллоидный раствор, застывающий при
18—20° С в однородный коллоидный студень
и рас­плавляющийся при 25—27° С.

В бактериологической практике обычно
применяют среды из продуктов животного
и растительного происхождения, содержащие
пептоны, экстрактивные вещества мяса,
кровь, сыворотку, сусло, углеводы и т.
п.

Необходимые питательные вещества должны
содержаться в среде в доступной форме
и в определенных соотношениях.

Питательные среды должны быть стерильными
(должно быть обеспечено получение чистых
культур микроорганизмов), прозрачными
(выросшие на них мик­роорганизмы
должны быть хорошо видны и иметь
опре­деленную величину рН).

Хранят готовые среды в прохладном месте,
в плотно закрывающихся шкафах или
ящиках, что предохраняет их от быстрого
высыхания. Надолго хранившихся средах
микробы развиваются слабо или совсем
не растут.

Питательные среды принято делить на
три группы:

1) стандартные (универсальные) —
предназначаются для культивирования
большинства микробов;

2) специальные элективные, избирательные
— предназначаются для выращивания
только определен­ного вида микробов,
рост других микроорганизмов на этих
средах подавляется;

3) дифференциально-диагностические —
предназначаются для изучения биохимических
свойств микробов с целью
дифференцирования различных видов
микроорганизмов.

Стандартные питательные среды

Мясопептонный бульон (МПБ).В
состав МПБ входят мясная вода,
пептон и поваренная соль. Для
приготовления мясной воды используют
свежее мясо крупного рогатого скота
или лошадей. Мясо освобождают от костей,
жира и сухожилий и пропускают через
мясорубку. Полученный фарш заливают
водой из расчета 1:2 (например, 1 кг фарша
заливают 2 л воды). Ставят на 18—20 ч в
прохладное место (4—6° С), затем кипятят
в течение часа и фильтруют через
ватно-марлевый фильтр. Фарш отжимают,
к фильтрату добавляют воды до
первоначального объема, разливают его
по колбам или бутылям и стерилизуют в
автоклаве при избыточном давлении 0,1
МПа в течение 30 мин. Или заливают
двукратным количеством воды, кипятят
в тече­ние часа, дают остыть, фильтруют
через ватно-марлевый фильтр. Фарш
отжимают, к фильтрату добавляют воды
до первоначального объема и стерилизуют
его в течение 30 мин при избыточном
давлении 0,1 МПа.

При варке мясной воды на поверхности
жидкости появляется некоторое количество
жира, который необхо­димо снять.

Для приготовления МПБ к мясной воде
добавляют 1% пептона и 0,5% химически
чистой поваренной соли, кипятят 10 мин,
фильтруют через бумажный фильтр,
устанавливают рН 7,2—7,4 прибавлением
щелочи или двууглекислой соды и снова
кипятят 10 мин. Профильтрованный бульон
должен быть цвета соломы и совершенно
прозрачным. Бульон разливают по пробиркам
и колбам, закрывают ватными пробками,
пробки обвязывают пергаментной бумагой
и стерилизуют 20—30 мин при избыточном
давлении 0,1 МПа.

Мясопептонный агар (МПА). К
мясопептонному бульону добавляют 2—3%
нарезанного агар-агар; нагревают в
автоклаве или в текучепаровом аппарате
до полного расплавления агар-агара.
Устанавливают рН 7,2—7,4. Дают остыть до
50° С, осветляют путем добавления белка
одного куриного яйца, разведенного
двойным количеством дистиллированной
воды . Ставят на 20 мин в автоклав при
избыточном давлении 0,1 МПа для свертывания
белка и тем самым осветляют среду,
фильтруют через слой марли и ваты (рис.
1). Можно пользоваться другой методикой.
К мясопептонному бульону добавляют
2—3% нарезанного агар-агара, нагревают
до полного расплавления его. После
остывания застывший плотный агар
вынимают из посу­ды и отрезают нижнюю
часть, содержащую осадок. За­тем вновь
расплавляют, разливают по пробиркам
и стерилизуют при избыточном давлении
0,1 МПа в течение 20 мин. Необходимо, чтобы
прозрачность агара позволяла свободно
читать напечатанный на бумаге шрифт
при наложении на него бактериологической
чашки с агаром, налитым слоем толщиной
20 мм. После стерилизации для того,
чтобы агар в пробирках застыл столбиком,
их оставляют в вертикальном положении.
Если нужно при­готовить агар скошенной
формы, пробирки с расплавлен­ным
агаром располагают в наклонном положении
так, чтобы среда заняла две трети
пробирки, и в таком виде оставляют до
застывания среды (рис. 2). При этом
про­бирки необходимо предохранять
от действия солнечного света.

Мясопептонный желатин (МПЖ).К
мясопептонному бульону добавляют 10%
зимой и не менее 18—20% летом измельченного
желатина и подогревают в текучепаровом
аппарате до полного растворения желатина.
Подщелачивают среду до рН 7,2 путем
добавления 10%-ного раствораNaОН.
После охлаждения до 60° С осветляют
яичным белком (в таком же количестве,
как и для МПА), подогревают в текучепаровом
аппарате 20—30 мин. В горячем виде фильтруют
через ватный или марлевый фильтр и
разливают по пробиркам. Стери­лизуют
дробно по 15—20 мин три дня подряд при
температуре 100° С.

Картофельная среда.Отбирают
крупный картофель, промывают щеткой
под водопроводной водой, удаляют
кожуру и поврежденные места. Клубни
снова моют под струей водопроводной
воды и помещают в 1%-ный раствор
двууглекислой соды на 2—3 ч для
ней­трализации кислой среды. Из
картофеля пробником вырезают столбики,
диаметр которых должен соответство­вать
ширине пробирок. Столбики помещают в
чашки с водой и разрезают по диагонали
на две части, подсуши­вают фильтровальной
бумагой и половинки помещают в пробирки
с перехватом внизу (в нижнюю часть этих
пробирок стекает вода, выделяемая при
стерилизации). За неимением специальных
пробирок используют обыч­ные пробирки,
поместив на дно стеклянные или деревян­ные
палочки, а на них — картофель. Стерилизуют
при избыточном давлении 0,1 МПа в течение
20—25 мин.

Пептонная вода. Приготовляют ее
различными способами. В 1 л дистиллированной
воды растворяют 5 г химически чистой
поваренной соли и 10 г пептона и сте­рилизуют
в автоклаве при избыточном давлении
0,1 МПа в течение 10 мин. Для выращивания
гнилостных бактерий пептонную воду
готовят несколько иначе: в 1 л
ди­стиллированной воды растворяют
30 г пептона. Стерили­зуют при избыточном
давлении 0,1 МПа в течение 20 мин.
Концентрированная глюкозопептонная
среда. В 1 л воды растворяют 100 г пептона
и 50 г поваренной соли, нагревают до
кипения, отфильтровывают, добавляют 50
г глюкозы, устанавливают рН 7,4— 7,6 (с
помощью насыщенного раствора углекислой
соды), разливают по 10 мл в колбы и склянки
емкостью 250 мл с поплавками и стерилизуют
3 дня по 30 мин текучим паром. Разведенная
глюкозопептонная среда. В 1 л воды
растворяют 10 г пептона и 5 г поваренной
соли, нагревают до кипения и добавляют
5 г глюкозы. Устанавливают рН среды
7,4—7,6, разливают по 10 мл в пробирки с
поплавками и стерилизуют 3 дня по 30 мин
текучим паром.

Сухой питательный агар. Содержит
рыбный или мясной бульон, агар, хлористый
и фосфорнокислый натрий. К 5 г порошка
агара добавляют 100 мл холод­ной
дистиллированной воды. Тщательно
взбалтывают и нагревают при помешивании
до полного растворения агара, не
допуская пригорания. По мере надобности
раствор фильтруют, разливают по
пробиркам, стерилизуют при избыточном
давлении 0,1 МПа в течение 20 мин.

В процессе микробиологического исследования выделяют чистые культуры микроорганизмов, осуществляют их культивирование с последующим изучением свойств. Культуры, состоящие из микроорганизмов одного вида, называют чистыми. Их используют при проведении диагностических мероприятий в процессе выявления инфекционных заболеваний, определяя видовую и типовую принадлежность.

Культивирование микроорганизмов осуществляется с помощью специальных субстратов – питательных сред. Среды для культивирования, выращиваемые в искусственных условиях, позволяют отследить все процессы микроорганизмов – питание, дыхание и размножение.

Особенности питательных сред, используемых для культивирования

От качества питательной среды зависят результаты исследования. Для создания оптимальных условия для жизнедеятельности микробов, среды должны соответствовать определенным параметрам:

• Питательность. В их составе должны присутствовать все необходимые вещества, обеспечивающие легкую усваиваемость, а также удовлетворение потребностей в пище и энергии. В некоторых случаях в состав питательных сред специально добавляют витамины и аминокислоты, обеспечивающие необходимый рост клеток.
• Оптимальная концентрация водородных ионов. Для обеспечения необходимой проницаемости оболочки клеток.
• Изотоничность. Для поддержания осмотического давления в среде в соответствии с давлением внутри клетки.
• Стерильность. Для исключения посторонних микробов, которые могут препятствовать росту.
• Оптимальная консистенция.
• Окислительно-восстановительный потенциал.
• Унифицированность. Обеспечивает содержание постоянного количества ингредиентов.

Для удобства слежения за ростом культивируемых культур, среда должна быть прозрачной.

Питательные среды можно классифицировать по нескольким параметрам:

• Компонентный состав. По этому критерию среды делят на натуральные и синтетические. Для натуральных используют продукты животного и растительного происхождения. Для приготовления синтетических сред используют органические и неорганические соединения химически чистого типа.
• Уровень плотности. По консистенции среды делятся на жидкие, плотные и полужидкие. Для получения необходимой плотности используют агар-агар или желатин.
• Состав. По этому критерию среды делятся на простые и сложные.
• Назначение. Среды делятся на общеупотребительные, специальные, элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие.

Особенности состава питательных сред для культивирования

Основные компоненты любой питательной среды – соединения углерода и азота. На натуральных средах хорошо растут и развиваются многие микроорганизмы, так как они содержат большое количество необходимых ингредиентов. Но их редко используют для изучения физиологии обмена веществ, так как их состав сложен и непостоянен. Для этого удобнее и информативнее использовать синтетические среды.

Приготовление питательных сред

При приготовлении сред следует использовать строго чистую посуду, которая не содержит посторонних веществ – щелочей или окислов, а также ржавчины. Оптимально использовать эмалированные, стеклянные или алюминиевые емкости. При необходимости приготовления больших объемов сред используют специальные варочные котлы или реакторы. Перед началом приготовления посуду тщательно моют, вытирают и просушивают. Стеклянные емкости предварительно необходимо прокипятить в хлор водородной кислоте.

Важно! Посуду для приготовления питательных сред запрещено использовать для других целей.

Основные компоненты большинства питательных сред – это продукты животного и растительного происхождения. Для приготовления питательных бульонов используют мясную воду или перевары от кислотного или ферментативного гидролиза. Чаще всего используют панкреатический перевар Хоттингера, гидролизаты казеина и кормовые дрожжи. На их основе готовят различные среды.

Этапы приготовления питательных сред

Процесс приготовления питательных сред состоит из следующих этапов:

1. Варка. Может осуществляться на открытом огне, на водяной бане, с использованием автоклава или варочного котла, которые нагреваются при помощи пара.
2. Установление оптимальной величины pH. Выполняют с применением индикаторных бумажек. Прибор используемый для этой операции – потенциометр или компаратор, которые представляют собой штативы с отсеками для пробирок и набора стандартов pH. При этом в пробирках сравнивают цвета жидкостей с эталонным цветом.
3. Осветление. Эта операция проводится, если в процессе приготовления среда становится мутной или темнеет. Для осветления можно использовать белок куриного яйца, смешанный с двойной порцией воды, который предварительно тщательно перемешивают и кипятят. Иногда для этих целей используют сыворотку крови.
4. Разлив. Осуществляется в специальные пробирки, объемом 3-5 или 10 мл. Это могут быть также флаконы или колбы, специальные бутылки. Если для стерилизации сред используется температура выше 100°С, то их разливают в сухие чистые емкости. Если для стерилизации используется меньшая температура, то разлив осуществляют в стерильные емкости. Для разлива используют воронку, на конце которой есть резиновая трубка с зажимом Мора.Фильтрация. Проводят для жидких и расплавленных желатиновых сред. Для этого используют влажные фильтры на основе бумаги или материи. Агаровые среды труднее фильтровать из-за того, что их застывание происходит достаточно быстро. Вместо этого для агаровых сред чаще всего используют отстаивание, с расплавлением в автоклаве.
5. Стерилизация. Режим стерилизации выбирают с учетом указаний к рецепту и в зависимости от компонентного состава. Примерная схема стерилизации приведена в таблице.
6. Контроль. Стерильность контролируют, используя термостат. Для этого среду ставят в него на двое суток. При отсутствии при осмотре признаков роста среду считают стерильной и отправляют ее на химический контроль. Химический – следующий вид контроля, благодаря которому окончательно устанавливают pH. Его проводят в химической лаборатории. Следующий вид контроля – биологический, с помощью которого определяют питательные свойства среды.

Хранение сред осуществляется при комнатной температуре, в специально предназначенных для этого шкафах. Составы с кровью или витаминами хранят в холодильниках.

Принципы составления простых и сложных питательных сред

Нормальный рост микроорганизмов возможен только в определенной питательной среде, состоящей их конкретного набора компонентов, кроме того эти компоненты должны содержаться в особых пропорциях.

Рецепты простых сред

Изотонический раствор хлорида натрия. Готовится на основе 1 литра дистиллированной воды, смешанной с 9 граммами натрия хлорида. Смесь фильтруют, и устанавливают требуемый pH, после чего при необходимости стерилизуют при температуре 120°С в течение получаса.

Мясопептонный бульон. Мясную воду смешивают с 1% пептона и 0,5% х.ч. натрия хлорида. Далее осуществляют кипячение на медленном огне в течение 10-15 минут до полного растворения ингредиентов. Далее устанавливают требуемый pH, после чего повторно кипятят до момента выпадения осадка. После проведения фильтрации объем дополняют до первоначального и проводят стерилизацию при 120°С в течение 20 минут.

Бульон Хоттинтера. Для приготовления используют перевар Хоттингера, который разводят водой в 5-6 раз с учетом содержания аминного азота. В разведенный перевар добавляют 0,5% натрия хлорида, с последующим кипячении на слабом огне до полного растворения соли. Нужный pH устанавливают в уже остывшей среде, после чего проводят фильтрацию, разлив и стерилизацию в течение 20 минут.

Мясопептонный агар. В готовый бульон (на этапе до или после стерилизации) доливают 2-3% агар-агар с последующим кипячением. Готовят состав на слабом огне с постоянным помешиванием, пока агар полностью не растворится. Для приготовления можно использовать автоклав или аппарат Коха. При необходимости готовую среду можно осветлять, фильтровать или стерилизовать.

В полужидком агаре 0,4-0,5 % агар-агара.

Питательный желатин. Для приготовления используют готовый бульон, в который добавляют 10-15 % желатина. Смесь подогревают, но не кипятят, доводя желатин до полного расплавления, после чего жидкость разливают по стерильным емкостям и проводят стерилизацию с использованием текучего пара.

Рецепты сложных сред

Среды с углеводами. Основной бульон или расплавленный агар дополняют нужным количеством определенного углевода (около 0,1-2%). После того, как он полностью растворился, состав наливают в стерильную посуду и проводят стерилизацию текучим паром. После проведения контроля стерильности среду можно использовать для культивации.

Среды с кровью. Для их приготовления используют простые стерильные среды, в которые в асептических условиях добавлена дефибринированная кровь (до 30%). Среды на основе агара перед добавлением расплавляют и остужают до 45 градусов Цельсия.

Важно! Запрещено растапливать среды с кровью, во избежание изменения свойств состава.

Среды с сывороткой крови. Готовят также, как и предыдущие составы. В основную среду добавляют от 10 до 20% сыворотки без консервантов, которая предварительно инактивирована.

Среды с желчью. В состав простых сред добавляют желчь (10-40% от объема). После устанавливают нужный pH, проводят стерилизацию при температуре 120 градусов по Цельсию в течение 20 минут.

Сухие среды

Выпускают также сухие среды, которые представляют собой порошки в флаконах. На их этикетках указываются правила приготовления составов. Это могут быть как простые, так и специальные среды, а также элективные и дифференциально-диагностические. Удобство сухих составов состоит в том, что они просты в приготовлении и могут использоваться даже в походных условиях. Они могут быть приготовлены из заменителей мяса.

Внимание! Компания Медика Групп занимается продажей автоматических микробиологических анализаторов и флаконов с питательными средами, но не оказывает услуги по сбору или расшифровке результатов анализов крови.

Поделиться ссылкой:

Suggest us how to improve StudyLib

(For complaints, use

another form
)

Белковой основой всех сред является питательный буль­он; в зависимости от состава среды остальные ингреди­енты добавляют к питательному бульону. Существует два спо­соба приготовления основного питательного бульона: 1) на мясной воде с добавлением готового пептона – это так на­зываемый мясопептонный бульон; 2) на переварах продук­тов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трип­сина — бульон Хоттингера, пепсина – бульон Мартена) или кислоты.

Приготовленные в лабораторных условиях гидролизаты раз­водят до нужного значения аминного азота (от 120 до 200 мг%) и добавляют входящие в рецептуру среды ингредиенты, пред­варительно отвешенные на лабораторных весах.

Растворение. Подготовленные навески ингредиентов поме­щают в стеклянную колбу или кастрюлю, доливают требуемое количество бульона или дистиллированной воды, кипятят на электрической плитке до растворения всех компонентов, уста­навливают необходимое значение рН: сначала с помощью ин­дикаторной бумажки, а затем потенциометра.

Фильтрование. Жидкие питательные среды фильтруют через двойной складчатый фильтр из фильтровальной бумаги, пред­варительно смоченной водой, или через фильтровальное по­лотно, которое накладывают на стеклянную воронку. Полот­няные фильтры значительно практичнее бумажных, так как годны к употреблению в течение длительного времени, в то время как бумажные фильтры употребляются лишь однократ­но. Рекомендуется иметь отдельные полотняные фильтры для каждого вида среды.

Агаровые среды в расплавленном состоянии лучше всего фильтруются через ватно-марлевый фильтр: стеклянную во­ронку покрывают марлевой салфеткой такого размера, чтобы концы салфетки были перекинуты через края воронки наружу; затем на марлю кладут слой гигроскопической ваты, фильтр смачивают горячей дистиллированной водой. Агар наливают на фильтр горячим.

Желатиновую среду фильтруют через бумажный фильтр, предварительно смоченный дистиллированной водой. Жела­тельно фильтрацию производить быстро в теплом помеще­нии.

Розлив сред. После осветления и фильтрации питательные среды разливают в колбы, флаконы, пробирки, бутыли или матрацы.

Для разливки жидких питательных сред пользуются одной из описанных ниже установок.

• На конец воронки, закрепленной в кольце штатива, наде­вают резиновую трубку, оканчивающуюся стеклянным на­конечником. На резиновую трубку накладывают зажим Мора. Под воронку подставляют сосуд для приема про­фильтрованной среды.
• • Для отмеривания и разливки определенных объемов среды пользуются градуированной бюреткой или собирают специ­альную установку (рис. 7.2). Стеклянную воронку и граду­ированную бюретку соединяют резиновыми трубками с двумя коленами стеклянного тройника, на третье его колено надевают резиновую трубку, заканчивающуюся стеклянным наконечником. На резиновые трубки, соединяющие ворон­ку с тройником, и наконечник накладывают зажимы Мора. Ослабляя первый зажим, наполняют градуированный ци­линдр жидкостью, затем, открыв второй зажим, выпускают отмеренное количество жидкости в сосуд для питательной среды. Первые порции жидкости до вы­теснения воздуха из трубок не учитываются.

При розливе сред края посуды нельзя смачивать питательной сре­дой, так как ватно-марлевые пробки, Приклеиваясь к стеклу во время сте­рилизации, вынимаются с трудом и оставляют в просвете отверстия сосу­да остатки ваты. Попадая в среду, они могут вызывать загрязнение ее посторонней микрофлорой.

Поверх ватно-марлевой пробки на колбы и флаконы с питательными сре­дами надевают бумажные колпачки.

Разливка плотных стерильных пи­тательных сред в чашки Петри. Плот­ную питательную среду (агар, жела­тин) во флаконах или пробирках рас­тапливают в водяной бане (сняв предварительно бумажные колпач­ки). Среду охлаждают до температуры 45–50 °С, сосуд берут в правую руку, левой рукой над огнем вынимают пробку и держат ее между мизинцем и ладонью, а края флакона или пробирки обжигают. Открытую посуду со средой держат в на­клонном положении, чтобы избежать попадания в среду мик­робов из воздуха. В асептических условиях вносят стерильную кровь, сыворотку или другие необходимые добавки, тщательно перемешивают содержимое сосуда. Левой рукой приподнимают с одной стороны крышку чашки Петри и выливают в нее питательную среду в количестве 15–20 мл, слегка покачивая чашку, чтобы среда распределялась равномерным слоем по ее поверхности (рис. 7.3).

В настоящее время ряд фирм изготовляют приборы-авто­маты для разливки агаризованных сред в чашки Петри, обес­печивающие высокую стерильность и точное дозирование разливаемых сред. Один из таких приборов изображен на рис. 7.4.

При застудневании агара образуется большое количество конденсационной воды, которая оседает на внутренней сторо­не крышки и увлажняет поверхность среды. В связи с этим перед посевом среды подсушивают: чашку в открытом виде помещают в термостат таким образом, чтобы крышка служила опорой для края ее дна, перевернутого средой вниз. Чтобы избежать образования конденсированной влаги, чашки с расплавленным агаром тотчас после заливки накрывают листом фильтровальной бумаги, которую стерилизуют вместе с чаш­кой. Бумага не должна касаться поверхности среды. Когда среда окончательно остынет, фильтровальную бумагу снимают, а чашки закрывают крышками.

Стерилизация питательных сред. Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в зависимости от тех ингредиентов, которые входят в их состав.

• Синтетические среды и все жидкие и агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре 121 °С.
• Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 110 – 112°С.
• Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыво­ротка крови, асцитическая жидкость или антибиотики и другие добавки), стерилизуют фильтрованием или стериль­ные вещества добавляют в питательные среды ex tempore.

Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мем­бранные фильтры, изготовляемые различными фирмами.

Приготовленные к употреблению стерильные питательные среды проверяют на стерильность. Для этого их ставят в термо­стат при температуре 37 °С. Среды, простерилизованные в ав­токлаве, выдерживают в термостате 1 сут, простерилизованные текучим паром – 3 сут.