Инструкция по криоконсервированию клеток крови

Проблема сохранения живых клеток вне организма человека, in vitro или ex vivo, является весьма актуальной для практической медицины. Так, например, в связи с расширением показаний к применению хирургических методов возросла потребность в постоянном наличии запасов полноценной крови и ее компонентов (эритро-, тромбо-, лейкоцитов). В результате широкого использования лучевой терапии и цитостатиков для лечения злокачественных опухолей и лейкозов возникла проблема купирования таких осложнений, как иммуно- и гемодепрессии путем трансплантации клеток крови или костного мозга. В последнее время интенсивно развивается и совсем новое направление — репродуктивная медицина, которая занимается искусственным оплодотворением на основе использования заранее выделенных из организма человека яйцеклеток и сперматозоидов, а также целых эмбрионов.

Однако необходимые для лечения индивидуума клетки не всегда можно быстро получить в «свежем» виде у подходящего донора. С другой стороны, клетки, выделенные заранее, быстро погибают вне организма при обычной температуре. Вот почему возникла проблема длительного хранения отдельных типов клеток человека, или их консервации.

Под консервацией в данном случае следует понимать сохранение биообъекта или его определенных свойств в искусственных условиях в течение определенного промежутка времени. Наиболее подходящим для этих целей оказался метод криоконсервации. Это комплекс мероприятий, обеспечивающих хранение биологических объектов при низких температурах в жизнеспособном состоянии. Изучением состояния биологических объектов в диапазонах температур ниже тех, к которым они адаптированы, занимается криобиология.

Для длительной криоконсервации клетки замораживают до температуры -80 °С или ниже. Необходимость использования сверхнизких температур связана с тем, что только при таких условиях в клетках практически полностью прекращаются все биохимические процессы. Так, при температуре 0 °С время жизни клеток весьма ограничено. При этом происходят следующие патофизиологические процессы:

1. «Выключение Na-насоса» и как следствие — набухание клеток.
2. Изменение фазового состояния липидов клеточных мембран и нарушение активности мембраносвязанных ферментов.
3. Преципитация слаборастворимых компонентов, изменение констант диссоциации некоторых веществ и, следовательно, рН растворов.
4. И наконец, по неустановленным еще причинам, быстрое охлаждение может привести к гибели клетки как таковой. Этот феномен назван термическим, или холодовым, шоком.

На практике установлено, что длительно сохранить клетки человека пока удается только в виде замороженной суспензии при температуре -80 °С или ниже. Сам процесс замораживания и последующего размораживания может оказать на клетку еще более губительное воздействие, чем просто охлаждение до 0 °С. Чтобы разрешить эту проблему, были изучены механизмы отрицательного влияния замораживания-размораживания и разработаны способы, позволяющие свести к минимуму повреждающие эффекты.

Физиологические основы криоконсервирования клеток

В процессе замораживания клеток необходимо выделить следующие методические этапы:
1. Приготовление клеточных суспензий (например, выделение необходимых клеток крови, сперматозоидов, яйцеклеток).
2. Подготовка клеточных суспензий к консервации (например, добавление криопротекторов).
3. Собственно замораживание.
4. Хранение криоконсервированных клеток в специальных емкостях при определенных температурах.

По диапазонам температур выделяют следующие этапы криоконсервации клеток.
1. От -37 до -25 °С — зона температурного оптимума биологической активности.
2. От -25 до -10 °С — зона перехода клеток в состояние неполного анабиоза (временное прекращение или торможение метаболических процессов, «переохлаждение» клеточных суспензий без кристаллизации воды).
3. От -10 до -80 °С — зона кристаллизации охлажденной и переохлажденной окружающей клетку и внутриклеточной воды и перехода клетки в состояние полного анабиоза.
4. От -80 до -130 °С — зона кристаллизации связанной и адсорбированной воды и рекристаллизации.
5. От -130 до -273 °С — зона отсутствия кристаллизации и рекристаллизации.

Итак, суспензия клеток в изотоническом растворе солей (например, физиологическом) должна начать замерзать при -0,6 °С — температуре замерзания данного раствора. Однако замерзание суспензии обычно начинается с кристаллизации т.н. внеклеточной (расположенной между клетками) воды только при понижении температуры до -10 °С, при которой и происходит формирование «очагов» кристаллизации воды. При этом клеточная суспензия в диапазоне температур от 0 до -10 °С является переохлажденной, т.е. находящейся в метастабильном, жидком состоянии. Замерзание внутриклеточной жидкости обычно начинается при температуре около -40 °С.

На этапах замораживания клеточных суспензий повреждение клеток могут вызвать следующие факторы:
1. Скорость замораживания. Следует отметить, что для каждого типа клеток существует своя, оптимальная скорость замораживания, которая определяется экспериментальным путем. Если суспензия клеток замораживается слишком быстро, то сначала образуются внутриклеточные кристаллы льда, которые разрывают клеточные органеллы и мембрану, приводя к лизису и гибели клеток после их размораживания. Наоборот, если клетки замораживать слишком медленно, сначала происходит замораживание внеклеточной воды, что приводит к образованию гиперконцентрированных растворов солей и изменению рН среды. Все это вызывает т.н. обезвоживание клеток и впоследствии их гибель.
2. Перегрев клеток при замораживании наблюдается в результате выделения тепла в момент фазового перехода жидкой внеклеточной воды в лед. Такой перегрев также может привести к необратимому повреждению клеток. Для его предотвращения в ряде случаев применяют программное, или контролируемое замораживание, когда в момент фазового перехода вода/лед суспензию клеток стараются кратковременно охлаждать очень быстро, что нейтрализует перегрев клеток.
3. Холодовой шок, о котором упоминалось выше.

Криопротекторы
Несмотря на перечисленные выше проблемы, в настоящее время удается заморозить и затем разморозить суспензии клеток, сохранив при этом их жизнеспособность. Этого можно добиться благодаря одновременному использованию двух подходов:
1. Применение т.н. криопротекторов — веществ, которые обладают способностью предупреждать развитие криоповреждений и обеспечивать сохранность клеток в жизнеспособном состоянии после замораживания и размораживания.
2. Охлаждение с определенной, оптимальной для данного типа клеток скоростью.

Криопротекторы разделяют на быстро проникающие в клетку низкомолекулярные вещества (диметилсульфоксид), медленно проникающие (глицерин) и непроникающие высокомолекулярные вещества (полиэтиленоксид). Общим механизмом действия криопротекторов является их способность связывать молекулы воды, что замедляет рост кристаллов льда. Это предупреждает быстрое нарастание концентрации солей во внеклеточной среде и повреждение клеток в результате осмотического шока.

Методы замораживания клеток и их хранение
Применяют два основных метода замораживания:
1. Неконтролируемое, или ручное замораживание, когда сосуд с суспензией клеток в смеси с криопротектором помещают в морозильную камеру (-80 °С) или в пары жидкого азота (-130°С) — замораживание происходит со скоростью примерно 1-3 °С в мин;
2. Контролируемое, или программное замораживание, при котором клеточные суспензии охлаждают с помощью специальных приборов — программных замораживателей.

Такой способ позволяет достичь наилучших результатов. Замороженные клетки хранят в электрических морозильных камерах при температуре от -80 до -130 °С или в сосудах Дьюара : жидким азотом при температуре -196 °С. Чем ниже температура в хранилище, тем дольше можно сохранить жизнеспособные клетки. Хотя при температуре ниже -150 °С существенной разницы уже не наблюдается, так как метаболические и кристаллизационные процессы в клетках не происходят.

Размораживание клеток
Необходимо для восстановления функциональной активности клеток после хранения. В физическом смысле под размораживанием понимают повышение температуры биологических объектов, сопровождающееся фазовым переходом льда в жидкое состояние. На этом этапе клетки могут быть необратимо повреждены в результате двух процессов:
1. Рекристаллизации льда — образования больших кристаллов из мелких и повреждения последними клеточных структур.
2. Гипотонического шока — резкого снижения осмолярности внеклеточной жидкости в результате быстрого плавления внеклеточного льда.

Для предотвращения этих феноменов на практике применяют несколько методов размораживания:
1. Нагрев теплопередачей — путем быстрого погружения сосудов с замороженными клетками в воду температурой около +40 °С.
2. Нагрев в сверхвысокочастотном (СВЧ) электромагнитном поле.
3. Размораживание теплопередачей с воздействием давления. В клинической медицине, как правило, ограничиваются наиболее простым способом — размораживанием в водяной бане.

Однако существенным моментом является предотвращение токсического действия криопротекторов после размораживания (особенно токсичен для клеток диметилсульфоксид).
Для этого обычно применяют два способа:
1. Размороженные клетки отмывают от криопротекторов in vitro путем постепенного добавления изотонического раствора, содержащего 10-20% сыворотки или альбумина, что смягчает эффекты изменения осмотического давления.
2. Свежеразмороженную клеточную суспензию быстро вводят внутривенно пациенту вместе с криопротектором, при этом плазма крови нейтрализует осмотическое и токсическое повреждение размороженных клеток (например, при трансплантации размороженного костного мозга).

Важным моментом является контроль жизнеспособности замороженных и размороженных клеток.
С этой целью используют два основных подхода:
1. Морфологическая оценка жизнеспособности, например, по исключению красителя трипанового синего (не проникает через неповрежденную мембрану и не окрашивает клетки).
2. Исследование функциональной активности размороженных клеток (выбор теста зависит от их типа — в случае кроветворных клеток это может быть изучение способности образования ими колоний в агаре под действием колониестимулирующих факторов; в случае сперматозоидов — оценка их подвижности и т.п.).

Криоконсервирование кроветворных клеток
Трансплантацию кроветворных клеток человека используют для восстановления гемопоэза у больных после воздействия цитостатических противоопухолевых препаратов или тотального облучения тела. У таких пациентов наблюдается полное исчезновение собственных клеток крови, и без пересадки кроветворных клеток они умирают от инфекций. Забор костного мозга или периферических стволовых клеток крови производят до начала интенсивной химиотерапии или облучения (курс продолжается до 1-й недели или более), а затем клетки переливают (трансплантируют) для восстановления гемопоэза. Для лечения некоторых заболеваний используют также аллогенные кроветворные клетки от HLA-совместимого здорового донора. Однако до трансплантации гемопоэтические клетки необходимо сохранять в жизнеспособном состоянии. Это можно сделать путем их замораживания с последующим размораживанием. В настоящее время для восстановления кроветворения используют клетки костного мозга, стволовые клетки периферической крови, клетки крови пупочного канатика новорожденных; разрабатываются подходы к трансплантации клеток эмбриональной печени.

Все типы кроветворных клеток могут быть подвергнуты криоконсервированию с последующим успешным размораживанием и восстановлением функциональной активности. Как правило, замораживают суспензию клеток в аутологичной плазме или сыворотке в присутствии криопротектора (обычно используют 10%-й диметилсульфоксид). Замороженные таким образом кроветворные клетки сохраняют жизнеспособность после хранения в течение 1-го года и более. Перед трансплантацией клетки быстро размораживают, и вводят суспензию внутривенно без отмывки от криопротектора.

Криоконсервирование зрелых клеток крови
Криоконсервирование эритро-, лейко-, тромбоцитов в последнее время применяется все реже. Это связано с большей терапевтической эффективностью свежевыделенных клеток (особенно тромбоцитов), сужением показаний к переливанию лейкоцитов в целом, а также с внедрением автоматических сепараторов клеток крови, которые позволяют получать большое количество свежих донорских клеток в необходимое время.

Однако на данном примере можно отметить различие в подходах к криоконсервации тех или иных типов клеток. Так, для эритроцитов в отличие от кроветворных клеток наиболее подходящими криопротекторами являются глицерин или полиэтиленоксид.

При этом оптимальная скорость замораживания эритроцитов составляет примерно 1000 °С в мин. Поэтому эритроциты помещают в т. н. замораживающий или ограждающий раствор с 30%-м глицерином и после инкубации при комнатной температуре в течение 20 мин для полной «глицеринизации» (проникновения криопротектора в клетки) погружают в специальных контейнерах непосредственно в жидкий азот. Такой подход неприемлем для замораживания ядросодержащих лейкоцитов или тромбоцитов, которые требуют постепенного, медленного охлаждения. В целом методики замораживания этих клеток сходны с технологией криоконсервации кроветворных клеток.

Криоконсервирование половых клеток
Относительно новым и весьма актуальным направлением в репродуктивной медицине является криоконсервирование сперматозоидов и яйцеклеток человека. Замораживание сперматозоидов уже практически стало рутинной процедурой в ряде зарубежных центров. Созданы специальные «банки» половых клеток, которые содержат материал, применяемый для искусственного оплодотворения. Важным аспектом является криоконсервирование спермы онкологических больных. Это дает им шанс иметь нормальное потомство после курса химиотерапии или облучения, в результате которых пациенты часто становятся бесплодными. Замораживание сперматозоидов производят с использованием режима, сходного с криоконсервацией кроветворных клеток. Однако в качестве криопротектора обычно применяют специфическую смесь на основе глицерина и желтка куриных яиц.

Что касается замораживания яйцеклеток, то эта процедура, практически вполне осуществимая, пока не вошла в обычную клиническую практику и находится на стадии разработки. Однако особенно перспективным представляется успешное замораживание и размораживание жизнеспособных эмбрионов человека (полученных, правда, на очень ранней стадии).

Заключение
В настоящее время проводятся экспериментальные испытания по трансплантации замороженных и размороженных живых тканей, таких как эндокринные железы, легочная ткань, ткани сердечной мышцы и др. В ряде центров интенсивно разрабатываются новые криопротекторы, которые в отличие от существующих не обладали бы токсическим действием на клетки. Теоретическая возможность создания таких веществ, а также постоянное совершенствование технологии замораживания позволяют надеяться, что в недалеком будущем медицина вплотную подойдет к решению проблемы криоконсервации отдельных органов.

«УТВЕРЖДАЮ»
Первый заместитель Министра
здравоохранения РФ
А.Д.ЦАРЕГОРОДЦЕВ
29.05.1995 г.
«СОГЛАСОВАНО»
Начальник Управления организации
медицинской помощи населению
А.Н.ДЕМЕНКОВ
29.05.1995 г.
ИНСТРУКЦИЯ
ПО КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЮ КЛЕТОК КРОВИ
ВВЕДЕНИЕ
Для долгосрочного консервирования клеток крови (эритроцитов, тромбоцитов) разработаны методы их замораживания и хранения при ультранизких (жидкий азот и его пары) и умереннонизких (электрические холодильники на -30 град. — -80 град.) температурах. Эти методы позволяют длительно (годами) сохранять клетки в жизнеспособном и функционально полноценном состоянии и после размораживания и специальной обработки применять их для трансфузий больным.
Для криоконсервирования эритроцитов используют два метода замораживания:
1. Очень быстрое охлаждение до -196 град. С. Метод не требует применения больших концентраций криопротекторных веществ, так как при этих условиях приобретает значение скорость теплоотвода от замораживаемой смеси эритроцитов с ограждающим раствором и хранение при постоянной ультранизкой температуре. Для этого применяют алюминиевые, стальные или полимерные контейнеры соответствующей конструкции и специальное жидкоазотное холодильное оборудование. Контейнеры с замороженными эритроцитами хранят в бункерах — камерах с жидким азотом (-196 град. С) или в его парах — над жидким азотом (-135 — 150 град. С).
2. Сравнительно медленное охлаждение с применением больших концентраций (до 40%) криопротекторных веществ, в основном, глицерина.
Медленное замораживание эритроцитной взвеси и хранение ее при умереннонизких температурах осуществляется в воздушной камере электрорефрижераторов, обеспечивающих соответствующие температуры (-30-80 град. С).
Для криоконсервирования тромбоцитов в настоящее время разрешен для клинического применения метод их контролируемого замораживания с криоконсервантом «Тромбокриодмац» с последующим хранением в жидком азоте при -196 град. С.
I. МЕТОДЫ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ УЛЬТРАНИЗКИХ
ТЕМПЕРАТУРАХ (В ЖИДКОМ АЗОТЕ ПРИ -196 ГРАД. С
ИЛИ ЕГО ПАРАХ ПРИ -150 ГРАД. С)
1. Метод быстрого замораживания эритроцитов с раствором
ЦНИИГПК 11
4
Замораживанию для длительного хранения подвергается эритроцитная масса в смеси с ограждающим раствором. Эритроциты получают из крови, заготовленной на одном из общепринятых глюкозо — нитратных растворов. Отделенная плазма хранится в замороженном состоянии до момента трансфузии или передается для приготовления из нее препаратов.
Замораживанию подвергают эритроцитную массу, хранившуюся не более 5 дней после заготовки крови от донора, предпочтительно в течение первых двух суток, так как в процессе хранения при положительных температурах снижаются показатели функциональной полноценности эритроцитов, в первую очередь, кислородтранспортной функции.
Для быстрого замораживания эритроцитов, предназначенных к
применению в клинике, в настоящее время рекомендуется
криоконсервант ЦНИИГПК 11 , содержащий в качестве криопротектора
4
глицерин, защищающий клетки от разрушения при замораживании.
1.1.1. В условиях асептики к эритроцитной массе (путем прокола
пробки бутылки или дистального конца трубки пластикатного мешка
иглой системы, соединенной с сосудом, содержащим ограждающий
раствор) медленно (в течение 5-8 мин) при помешивании эритроцитов
добавляют раствор ЦНИИГПК 11 в соотношении 1:1.
4
1.1.2. После перемешивания смесь эритроцитов с ограждающим раствором переливают через ту же систему в алюминиевый гофрированный контейнер с двумя штуцерами, для чего на один штуцер надевают резиновую трубку длиной 4-5 см, соединяемую с системой, второй штуцер служит для выхода воздуха из контейнера.
Примечание: для ускорения заполнения контейнера можно применить повышенное давление стерильного воздуха через воздухоотводящую иглу во флаконе, из которого переливается в контейнер смесь эритроцитов с раствором.
1.1.3. После заполнения контейнера взвесью эритроцитов штуцеры контейнера герметизируют путем прочного навинчивания тефлоновых колпачков. На стенку контейнера у основания штуцеров наносят номер, под которым в специальном регистрационном журнале указаны все паспортные данные крови, находящейся в этом контейнере. Взвесь эритроцитов в контейнере следует оставить на 15-20 минут при комнатной температуре для полной глицеринизации эритроцитов. Более длительная экспозиция приводит к частичному гемолизу эритроцитов.
1.1.4. Замораживание производят путем погружения контейнера с эритроцитной взвесью в предназначенную для этого ванну с жидким азотом (температура -196 град. С). Замораживание дозы в 250 мл продолжается около двух минут. Об окончании замораживания судят по прекращению выделения паров азота из трубки в крышке «ванны для замораживания».
1.1.5. После замораживания контейнер с кровью переносят в специальный жидкоазотный бункер или камеру для длительного хранения замороженных биоматериалов.
1.1.6. При необходимости оттаять эритроциты нужный контейнер вынимают из хранилища и помещают в специальную емкость с жидким азотом, которую подносят к ванне для оттаивания. Оттаивание эритроцитов производят в ванне с подогретой водой (температура +45 град. С) при автоматическом покачивании (200 качаний в минуту) контейнера с кровью в течение 25 секунд. Допускается производить оттаивание при тех же температурных условиях в водяной бане путем покачивания вручную в течение 50-60 секунд.
1.1.7. Для подготовки размороженных эритроцитов к переливанию производят их отмывание от глицерина, проникшего из ограждающего раствора внутрь клеток. Введение неотмытых эритроцитов в кровоток реципиента вызвало бы их гемолиз из-за большого осмотического градиента. Для отмывания применяют растворы с последовательно снижающейся концентрацией ингредиентов (см. Приложение 1). Отмывание эритроцитов производят с помощью серийного центрифугирования.
После оттаивания размороженную взвесь эритроцитов (250 мл) из алюминиевого контейнера переводят в полимерный контейнер <*>, добавляют в соотношении 1:1 один из гипертонических растворов (250 мл), предназначенных для первого этапа отмывания, контейнер со смесью клеток герметизируют и центрифугируют при 1100 g в течение 7 минут при 4 град. С.
———————————
<*> Для этого используют контейнеры типа Гемакон 500 или специальные контейнеры для отмывания эритроцитов (ТУ 64-2-419-90).
1.1.8. После остановки центрифуги контейнер передают в бокс. После снятия надосадочной жидкости к эритроцитам постепенно, при постоянном их помешивании, добавляют другой отмывающий раствор, предназначенный для второго этапа отмывания, в количестве до 400 мл. Взвесь осторожно перемешивают, контейнер герметизируют.
1.1.9. Контейнер со взвесью эритроцитов центрифугируют при том же режиме в течение 5 минут. После второго центрифугирования процедуру отмывания повторяют с добавлением раствора, предназначенного для третьего этапа отмывания. Взвесь центрифугируют третий раз и супернатант удаляют. К оставшимся в полимерном контейнере отмытым эритроцитам добавляют, в соотношении 1:1 ресуспендирующий раствор ЦНИИГПК 8в (Приложение 1) и контейнер герметизируют. При необходимости получения для переливания размороженной отмытой эритроцитной массы с более высоким гематокритом количество добавляемого ресуспендирующего раствора ЦНИИГПК 8в допустимо уменьшить до соотношения 1:0,5, особенно если не предполагается длительное, в течение суток, хранение конечного продукта.
1.1.10. Отмытые ресуспендированные эритроциты хранят при 4 +/- 2 град. С и используют для переливания в течение 24 часов с момента заготовки.
1.2. Метод быстрого замораживания эритроконцентрата
с ограждающим раствором ЦНИИГПК 11
5
Замораживание концентрированной массы эритроцитов позволяет помещать в стандартные алюминиевые контейнеры (емкостью 250 мл) удвоенные объемы эритроцитов и, следовательно, хранить в жидкоазотных хранилищах большие их запасы по сравнению с методом замораживания разведенной взвеси эритроцитов. Это достигается удалением перед замораживанием (по окончании глицеринизации эритроцитов) избытка ограждающего раствора. Кроме того, метод позволяет при отмывании сократить число процедур отмывания размороженных эритроцитов и уменьшить объем отмывающих растворов.
1.2.1. Для криоконсервирования эритроцитов в виде
эритроконцентрата применяют ограждающий раствор ЦНИИГПК 11 — М или
5
ЦНИИГПК 11 — C (см. Приложение 1). В бутылку или полимерный
5
контейнер, содержащий эритроцитную массу, медленно (в течение 5-8
минут) при постоянном помешивании добавляют в соотношении 1:1
криоконсервант ЦНИИГПК 11 .
5
1.2.2. После перемешивания эритроцитов с криоконсервантом бутылку или полимерный контейнер герметизируют и передают на центрифугирование при 1100 g в течение 20 минут при +4 град. С. Затем надосадок отделяют от эритроцитов, оставшийся эритроконцентрат в количестве 250 мл (из двух бутылок или из одного полимерного контейнера) переливают в стандартный металлический контейнер, герметизируют, паспортизируют.
1.2.3. Контейнер с эритроконцентратом замораживают путем погружения в ванну с жидким азотом. Полное замерзание завершается за 2-2,5 минуты. Контейнеры с замороженным эритроконцентратом быстро переносят в жидкоазотное хранилище и хранят в жидком азоте (-196 град. С) или в его парах (- 150 град. С).
1.2.4. При подготовке к трансфузии оттаивание эритроконцентрата производят в ванне с водой (температура + 45 град. С) при автоматическом (200 качаний в минуту) или ручном покачивании контейнера. Оттаивание завершается при ручном покачивании за 2 минуты, при автоматическом качании — за 25-30 секунд.
1.2.5. Для деглицеринизации оттаянную эритроцитную массу переливают в полимерный контейнер <*>, в котором производят все этапы отмывания.
———————————
<*> типа Гемакон 500 или контейнер для отмывания эритроцитов (ТУ 64-2-219-90)
Для отмывания применяют как магнитные, так и солевые растворы (п.1.1.7., Приложение 1).
К 250 мл размороженного эритроконцентрата добавляют постепенно при помешивании 250-300 мл отмывающего маннитного или солевого раствора N 1, контейнер герметизируют и центрифугируют 10 минут при 1100 g в рефрижераторной центрифуге при 4 град. С.
1.2.6. Надосадочную жидкость отделяют, к оставшимся эритроцитам добавляют 300-400 мл раствора N 2 для второго этапа отмывания, центрифугируют в вышеуказанном режиме в течение 5 минут и снова отделяют надосадочную жидкость.
1.2.7. К оставшимся эритроцитам добавляют раствор N 3 для третьего этапа отмывания (300-400 мл), снова центрифугируют и снимают надосадок. При наличии в надосадке значительного гемолиза (определяемого визуально) третий этап отмывания повторяется. Всего для отмывания 250 мл размороженного эритроконцентрата, полученного из 500 мл консервированной крови, используют максимально 1000 мл отмывающих растворов при трехкратном отмывании и 1350 мл отмывающих растворов — при четырехкратном отмывании.
1.2.8. К отмытому эритроконцентрату (150-200 мл) через систему — магистраль добавляют плазмозамещающий раствор ЦНИИГПК 8в (см. 1.1.9), смесь осторожно и тщательно перемешивают. При необходимости ресуспендированную эритроцитную взвесь через систему для переливания крови фильтруют в бутылку емкостью 500 мл из-под ресуспендирующего раствора с целью удаления возможных сгустков. Бутылку со взвесью герметизируют, наклеивают этикетку и направляют на хранение или непосредственно в лечебное учреждение для трансфузии.
2. Метод медленного замораживания
и хранения эритроцитов при -30 град. С
Метод предназначен для криоконсервирования эритроцитов при температуре -30 град. С и предусматривает использование электрических холодильников. Замораживание осуществляют в стеклянных бутылках или полимерных контейнерах, в которых заготавливается кровь.
Для криоконсервирования эритроцитов, их длительного хранения в
электрохолодильниках при -30 град. С и последующего отмывания
методом серийного центрифугирования применяют один из двух
ограждающих растворов (ЦНИИГПК 11 55, ЦНИИГПК 11 ).
5 5
2.1. Смешивание эритроцитной массы с ограждающими растворами
проводят в первичных емкостях, в которых была заготовлена
консервированная кровь: бутылки вместимостью 250 мл, полимерные
контейнеры на 500 мл. С раствором 11 55 эритромассу смешивают в
5
соотношении 1:1.
При замораживании с криоконсервантом 11 эритроцитную массу
5
смешивают с раствором в соотношении 1:1,6. К каждым 125 мл
эритромассы добавляют 200 мл раствора.
2.2. Глицеринизацию эритроцитов осуществляют в течение 10 минут при легком покачивании сосуда с кровью. После герметизации, маркировки и экспозиции при комнатной температуре в течение 15-20 минут бутылки или полимерные контейнеры помещают в специальные сетки (кассеты, бязевые мешки, коробки) и переносят для замораживания и хранения в электрохолодильники.
Полимерные контейнеры с глицеринизированной эритромассой, помещенные в кассеты или картонные коробки, в камере электрохолодильника размещают в горизонтальном положении. Через сутки после замораживания при необходимости они могут быть переведены в вертикальное положение.
2.3. При замораживании эритроцитов в виде эритроконцентрата
эритроциты медленно (в течение 10 мин) при постоянном помешивании
соединяют с раствором 11 55 в соотношения 1:1. Взвесь
5
центрифугируют в течение 20 минут — 1100 g при +4 град. С. После
удаления надосадочной жидкости и герметизации сосуда его помещают
на хранение в электрохолодильник.
2.4. Оттаивание проводят в водяной бане с температурой 38-40 град. С в течение 6-10 минут до полного исчезновения льда.
2.5. Деглицеринизацию размороженных эритроцитов проводят в полимерных контейнерах вместимостью 500 мл с применением солевых или маннитно — солевых растворов.
Этапы отмывания эритроцитов,
замороженных с раствором 11 55
5
I этап
К размороженной эритроцитной взвеси (250 мл), переведенной из емкости для замораживания в полимерный контейнер, постепенно добавляют, помешивая, вначале 100 мл 6% раствора NaCI (или 16% раствора маннита) через 2-3 минуты — 150-200 мл 2% раствора NaCI (или 5% раствора маннита). Разведенную эритроцитную взвесь центрифугируют при 1100 g в течение 10 минут.
II этап
После удаления надосадочной жидкости к оставшимся эритроцитам, после их осторожного перемешивания, добавляют 400-450 мл 1% раствора NaCI (или 2,5% раствора маннита). Взвесь эритроцитов центрифугируют при том же режиме, но в течение 5 минут и снова отделяют надосадочную жидкость.
III этап
Повторить этап II.
После удаления надосадочной жидкости отмытые эритроциты ресуспендируют в растворе ЦНИИГПК 8в (см. 1.1.9).
Этапы отмывания эритроцитов, замороженных с раствором 11
5
I этап
К размороженной эритроцитной взвеси (325 мл), хранившейся в полимерном контейнере, добавить, постепенно помешивая, 200 мл 4% раствора NaCI (или 16% раствора маннита). Через 2-3 минуты разведенную взвесь эритроцитов центрифугируют при 1100 g в течение 10 минут.
II этап
После удаления надосадочной жидкости к оставшимся эритроцитам, после их перемешивания, добавляют 400-450 мл 2% раствора NaCI (или 5% раствора маннита). Взвесь центрифугируют при том же режиме в течение 5 минут и снова удаляют надосадочную жидкость.
III этап
Оставшиеся эритроциты разводят 400-450 мл 1% раствора NaCI, центрифугируют при том же режиме в течение 5 минут, удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют в растворе 8в (см. 1.1.9).
2.6. Для деглицеринизации эритроконцентрата необходимо дозу (250 мл) эритроконцентрата разделить приблизительно по 125 мл в два контейнера вместимостью 500 мл и отмывать так же, как и размороженную эритровзвесь. Если после 3-го центрифугирования удаляемый супернатант будет иметь интенсивное окрашивание, следует ввести 1-2 дополнительных этапа центрифугирования с использованием последнего отмывающего раствора (1% NaCI) в объемах 400-500 мл. Отмытые клетки ресуспендируют в растворе ЦНИИГПК 8в (см. 1.1.9).

УДК 62-9

Резервирование компонентов крови и гемопоэтических клеток с использованием низких температур: состояние и перспективы внедрения в интересах обеспечения пострадавших в чрезвычайных условиях

Канд. мед. наук В. Н. ВИЛЬЯНИНОВ1, канд. мед. наук С. П. КАЛЕКО, д-р биол. наук Ш. М. БАГАУТДИНОВ2, канд. мед. наук В. Н. СЕМЕЛЕВ, канд. мед. наук Н. Н. ПОПОВА 1Viljaninov@mail.ru, 2bagautdinovshm@ mail.ru Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6 Д-р мед. наук С. В. СИДОРКЕВИЧ, Г. И. ПЕТРЕНКО info@almazovcentre.ru Федеральный медицинский исследовательский центр им. В. А. Алмазова 197341, Санкт-Петербург, ул. Аккуратова, 2

Рассмотрены ключевые этапы эволюции представлений об основных механизмах криоконсервирования клеток крови человека. Представлен анализ современных технологий криоконсервирования и применяемых криозащитных растворов. Перечислены разработки по криоконсервированию биообъектов, выполненные при участии специалистов ВМА им. С. М Кирова. Сформулированы первоочередные вопросы развития низкотемпературного консервирования клеток крови и костного мозга, предложены оптимальные их решения. Накопленный опыт низкотемпературного консервирования клеток крови и костного мозга свидетельствует ореальной возможности создания и внедрения в практику высокоэффективных методов получения аллогенных и аутогенных компонентов крови, их резервирование путем замораживания при температуре -150… — 196 °С, -65… — 80 °С и -25… — 40 °С. Авторами освещены современные направления поиска перспективных технологий криоконсервирования и криофилактиков, которые обеспечат максимальную морфофункциональную сохранность и клиническую эффективность применения эрит-роцитосодержащих компонентов крови.

Ключевые слова: криоконсервирование, эритроциты человека, глицерин, тромбоциты.

Reserving components of the blood and hematopoietic cells using low temperatures: current status and prospects for implementation in the interests of victims in emergency situations

Ph. D. in medicine V. N. VILYANINOV1, Ph. D. in medicine S. P. KALEKO, Dr. biol. Sc. Sh. M. BAGAUTDINOV2, Ph. D. in medicine V. N. SEMELEV, Ph. D. in medicine N. N. POPOVA 1Viljaninov@maiLm, 2bagautdinovshm@ mail.ru Army medical college of MAUD RF 194044, Russia, St. Petersburg, Academician Lebedev St., 6 Dr. medical Sc. S. V. SIDORKEVICH, G. I. PETRENKO info@almazovcentre.ru Federal Almazov Medical Research Centre 2 Akkuratova street, St. Petersburg 197341 Russia

The basic stages of evolution of understanding of the basic mechanisms of human blood cell cryopreservation are discussed. Analysis of modern cryopreservation technologies and applied cryoprotective solutions is presented. Researches in the filed of cryopreservation made with the help of specialists from Army medical college of MAUD RF are listed. Perspective directions of researches in the field of blood and bone marrow cell cryopreservation and optimal solutions are shown. There exist the possibility of creating and implementing high effective methods of producing allogeneic and autogenic blood parts and their reserving by freezing at -150… — 196 oC, -65… — 80 oC and -25… — 40 oC. Modern trends for cryopreservation and cryophilactic research aiming to provide maximum morphofunctional preservation and clinical effectiveness of red blood cells application are shown. Keywords: cryopreservation, human red blood cells, glycerol, platelets.

Введение. Исторический экскурс

Готовность к оказанию помощи пострадавшим, при возникновении чрезвычайной ситуации (ЧС) техногенного или антропогенного (локальный вооруженный конфликт) характера, напрямую связана с наличием запасов гемотрансфузионных средств, а при лучевых поражениях и гемопоэтических клеток. Особенно актуальной такая постановка вопроса является в отношении социальных катастроф, перерастающих в локальные военные конфликты (Египет, Сирия и др.). Опыт локальных войн последних трех десятилетий свидетельствует о высокой доле (до 50%) среди пострадавших и раненых лиц с тяжелыми сочетанными и множественными травмами, сопровождающимися значительной или массивной кровопотерей. Это обстоятельство обусловлено применением воюющими сторонами современных видов мин-но-взрывного и высокоточного оружия, используемого для нанесения по стратегическим объектам и населенным пунктам. При этом санитарные потери включают как военнослужащих, так и гражданское население [1].

Прогнозирование высокой потребности в компонентах крови, в случае возникновения войны, предопределило создание в США хорошо оснащенных банков крови Красного Креста, каждый из которых мог хранить до 60000 доз крови. В 1970 г. было 59 таких банков [2]. На этой основе в США был создан стратегический запас донорской крови [3]. Замороженные эритроциты и свежезамороженная плазма использовались при оказании помощи раненым во Вьетнаме (на госпитальных судах «Рипоуз» и «Санкчуэри»).

В 1985 г. в США была утверждена программа снабжения кровью и ее компонентами вооруженных сил США, предусматривавшая резервирование в замороженном состоянии эритроцитов и свежезамороженной плазмы, их рассредоточение в странах НАТО, а также систему доставки этих средств в районы боевых действий. Во время боевых действий против Ирака (операции «Буря в пустыне» и «Щит в пустыне») замороженные компоненты крови использовались на госпитальных судах «USNS Comfort» и «USNS Mercy» [4, 5].

В СССР разработка и внедрение в практику низкотемпературного консервирования эритроцитов начата в шестидесятые годы по инициативе профессора А. Е. Киселева.

В 1980-1993 гг. разработка методов и технических средств для низкотемпературного консервирования эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, клеток костного мозга в интересах военно-медицинской службы и решения проблем военного времени была предметом постоянного внимания специальной союзной проблемной комиссии. В этот период НИЛ — Центр крови и тканей ВМедА им. С. М. Кирова приобрел статус «полигона» по разработке, доклиническому и клиническому изучению методов замораживания биологических объектов и предлагаемых технических средств. В планах НИР академии постоянными стали темы по разработке и совершенствовании организационных принципов внедрения в практику работы военно-медицинской службы различных методов консервирования клеток крови, костного мозга и тканевых трансплантатов, доклиническое и клиническое изучение их эффективности. В частности, была доказана высокая

лечебная эффективность криоконсервированных сред «омоложенных» эритроцитов, тромбоцитного концентрата с раствором «Тромбокриодмац», лейкоцитов и ядро-содержащих клеток костного мозга с растворами «Лей-кокриодмац» и 10%-ного диметилсульфоксида. Последующее совершенствование методов низкотемпературного консервирования клеток крови имело целью поиск новых криофилактиков для замораживания эритроцитов материалов для изготовления одноразовых полимерных контейнеров для хранения биообъектов, новых, отвечающих современным условиям работы военно-медицинской службы в мирное время и при возникновении ЧС, медицинских технологий низкотемпературного консервирования клеточных суспензий. Данные направления научных исследований являются доминирующими в последние 30 лет.

Были предложены следующие высокоэффективные методы: низкотемпературное консервирование эритроцитов под защитой пропандиосахароля (ПДС) и комбинированного раствора на основе пропиленгликоля и ди-метилацедамида [6], замораживание тромбоцитов с 2,5% раствором диметелацетамидом при -80 0С в полимерных контейнерах [7], замораживание клеток костного мозга с диметилацетамидом [8].

В Военно-медицинской академии им. С. М. Кирова по материалам выполненных исследований защищены три докторские и пять кандидатских диссертаций. Кроме того, по результатам клинического изучения криоконсервиро-ванных компонентов крови у пациентов с онкологическими заболеваниями, болезнями органов груди и живота, ожоговой травмой, тяжелой сочетанной травмой защищены 20 диссертационных работ. Это свидетельствует о наличии в ВМедА им С. М. Кирова значительного творческого потенциала, способного находить оптимальные решения по разработке и внедрению в практику современных высокотехнических криогенных медицинских технологий. Так, в 2007-2012 гг. были разработаны медицинские технологии по замораживанию эритроцитов с 25% раствором глицерина в полимерных контейнерах производства ОАО «Синтез» [9], по замораживанию тромбоцитного концентрата с 2,5% раствором диметилацетамида.

Ниже приведены разработки по криоконсервирова-нию биообъектов, выполненные при участии специалистов ВМедА им. С. М Кирова:

— криоконсервирование «омоложенных» эритроцитов;

— комплекс технических средств для замораживания и хранения компонентов крови и клеток костного мозга (биокомплекс 2);

— криоконсервирование тромбоцитов под защитой криоконсерванта «Тромбокриодмац»;

— криоконсервирование лейкоцитов под защитой криоконсерванта «Лейкокриодмац»;

— *криоконсервирование клеток костного мозга с раствором диметилацетамида;

— криоконсервирование эритроцитов с раствором ПДС;

— *низкотемпературное консервирование эритроцитов с комбинированным раствором пропиленгликоля (18,5%) и диметилацетамида (5%);

— *криоконсервирование роговицы и других тканевых аллотрансплантатов;

— низкотемпературное консервирование эритроцитов с 40% раствором глицерина в полимерных контейнерах;

— криоконсервирование эритроцитов с 20% раствором глицерина в полимерных контейнерах ОАО «Синтез».

* — самостоятельная разработка специалистов ВМедА им. С. М Кирова.

Первоочередные вопросы развития низкотемпературного консервирования клеток крови и костного мозга

Как и при решении любого сложного вопроса, продвижение в практику низкотемпературных технологий резервирования компонентов крови и гемопоэтических клеток предопределяется наличием:

— системы подготовки специалистов в этой области;

— налаженной системы выпуска отечественных технических средств такого назначения, криозащитных, отмывающих и ресуспендирующих растворов (в РФ криогенная техника трансфузиологического назначения и указанные растворы не производятся, законодательно этот вопрос не решен);

— нормативные и методические документы, регламентирующих медицинские технологии, утвержденные МЗ РФ, устарели и утратили свою силу.

Оптимальное решение этих вопросов возможно только в государственном масштабе, что соответствует целям и задачам укрепления обороноспособности страны и повышения готовности к оказанию помощи пострадавшим в техногенных и иных катастрофах мирного времени.

Оценка способов низкотемпературного консервирования клеток крови и костного мозга

Эффективность замораживания биологических объектов предопределяется рецептурой используемого криозащитного раствора, режимом и температурой замораживания, материалом и конструкцией гемоконтейнера, величиной и стабильностью температуры хранения, режимом размораживания [10].

Наилучшие показатели сохранности клеток крови и гемопоэтических клеток, наибольшая продолжительность хранения в замороженном состоянии возможны при температурах, при которых полностью прекращается действие всех повреждающих факторов. В таком состоянии замороженный объект может сохранять свои функциональные свойства и морфологические характеристики бесконечно долго (при условии обеспечения стабильности показателей температуры). Следовательно, при прочих равных, для резервирования компонентов крови и клеток костного мозга наиболее приемлемыми являются методы криоконсервирования (температура хранения -130 0С или ниже в зависимости от состава криозащитного раствора) [10, 11]. Не менее важным достоинством жидкоазотной технологии (хранения в жидком азоте) является надежность. В зависимости от конструкции хранилища, хранимые биообъекты в условиях

невозможности дозаправки жидким азотом остаются не поврежденными до 28 сут. При хранении замороженных биообъектов в электрическом морозильнике безопасное время для клеток после отключения электропитания составляет менее 24 ч. В связи с перечисленными выше причинами в отделениях низкотемпературного консервирования крови МЗ и Соцразвития РФ в 2010 г. было заморожено только 56700 доз эритроцитов, выдано 55000 доз декриоконсервированных эритроцитов, что составило 2,7% от общего объема заготовленных эритроцит-ных компонентов [12]. Во всех случаях замораживание осуществляли под защитой глицерина при температуре -20… -40 оС по методике В. Н. Мельниковой, обеспечивающей сохранность клеток в течение от 6 мес ( -20 оС) до 1,5 года ( -40 оС) [13]. Этот метод не в полной мере отвечает требованиям и задачам резервирования эритроцитов для применения при возникновении чрезвычайных ситуаций. Оптимальное решение проблемы возможно при использовании методов ориентированных на хранении при -150. -196 0С или при -80 оС. Результаты выполненных нами научных исследований клеток крови и костного мозга, замороженных при -196 оС в алюминиевых контейнерах в жидком азоте с использованием в качестве криозащитных растворов 20% глицерина и 24,5% диметилацетамида (ЦНИИГПК 115), позволяют считать, что отвечающие требованиям морфологические характеристики и функциональные свойства эритроцитов сохраняются 20 лет (срок наблюдения, В. Н. Вильянинов), костного мозга — 33 года (срок наблюдения, исследования на облученных мышах выполнены д. м. н. Александровым В. Н). В литературе имеются сведения о сохранении морфологической и функциональной полноценности эритроцитов в замороженном состоянии с 40% раствором глицерина при -80 оС в течение 37 лет [14].

Установлено наличие факторов риска посттрансфузи-онных осложнений, свойственных, главным образом, с металлическими контейнерами для хранения клеток крови и костного мозга в замороженном состоянии. Эти факторы в сочетании с высокой стоимостью таких изделий стали непреодолимым препятствием их применения и стимулировали процесс создания таких изделий из полимерных материалов. Работы Valeri С. R. [3, 14], показали перспективность данного направления исследований. Выполненные нами в 1991-2000 гг. сравнительные комплексные исследования замораживания эритроцитов с 20% раствором глицерина (ЦНИИГПК 114) и ПДС показали, что оба метода по качеству конечного продукта не имеют достоверных различий. Вместе с этим выявлены определенные преимущества метода криоконсервирования эритроцитов с ПДС:

— ПДС в 1,7-3,3 раза менее токсичен, чем глицерин, скорость его проникновения в клетку и выхода из нее выше, чем у глицерина. Взвесь эритроцитов с глицерином более вязкая, как следствие этого более высокая трудоемкость процесса отмывания эритроцитов от глицерина;

— глицерин обладает более высокой, чем ПДС осмотической активностью, в результате чего суммарные потери эритроцитов в процессе замораживания, размораживания и отмывания более чем в 2 раза (12,5%) выше, чем при применении ПДС (5,5%);

— экспозиция эритроцитов с ПДС до замораживания и после размораживания может быть более продол-

жительной, чем с глицерином; размороженные эритроциты с ПДС могут сохраняться без отмывания несколько суток, что невозможно в случае применения глицерина в качестве криофилактика.

Можно предположить, что применение пропиленг-ликоля (криофилактика, входящего в состав ПДС) позволит решить проблему транспортировки криоконсерви-рованных эритроцитов. Таким образом, с позиции оперативности решения вопроса доставки резервированных эритроцитов к месту их использования, предпочтение может быть отдано применению метода замораживания этих клеток с раствором ПДС.

Учитывая сложность и трудоемкость основных этапов криоконсервирования биологических объектов и высокий риск контаминации, был разработан и внедрен в практику аппарат Haemonetics ACP 215. Метод рассчитан на использование криоконтейнеров однократного применения, конечной концентрации глицерина 40% и температуры хранения -65… -80 оС. По данным источника [15], в день размораживания сохранность эритроцитов составила 83,7 ± 2,6%, на 14 сут их хранения в растворе AS-3-78,9 ± 8,8%. Однако, несмотря на повышенный интерес к вопросу возможности хранения размороженных отмытых эритроцитов в течение 2-х недель, к подобному решению на практике следует относиться критически, так как процесс биологического старения клеток отменить или остановить невозможно.

Авторами [6] разработана медицинская технология замораживания эритроцитов с использованием аппарата Haemonetics ACP 215 при -150. -196 оС в крио-контейнерах «Фрезениус» DF-1000 и DF-700 с использованием растворов фирмы «Haemonetics», предназначенных для замораживания таких клеток при температуре -80. -65 оС. В предлагаемой методике соблюдены основные требования к замораживанию эритроцитов при температуре -150. -196 оС: концентрация глицерина составляет 19-20%, высокая скорость теплоотвода обеспечивается прямым погружением криоконтейнеров с эритроцитами в жидкий азот в горизонтальном положении. Автоматические процедуры глицеринизации и деглицеринизации осуществляются при температуре 29.32 оС. Для отмывания используются 5,85% раствор натрия хлорида и 0,9% раствора NaCl с 0,2% раствором глюкозы. Проведены исследования 164 образцов эритроцитов. Установлено, что все исследованные образцы отвечают требованиям «Технического регламента .» [16] (таблица).

В девяностые годы в ВМедА им. С. М. Кирова, В. Н. Вильяниновым предложен и апробирован метод

Показатели качества декриоконсервированных эритроцитов (с использованием аппарата Haemonetics AC? 215)

Показатель Средняя Max Min

Общий гемоглобин в дозе, г 53,2 58,56 36,7

Свободный гемоглобин, г/л 0,24 0,6 0,1

Свободный гемоглобин в дозе, г 0,038 0,08 0,014

Осмолярность, мосм/кг Н2О 348,6 0,6 0,1

низкотемпературного консервирования эритроцитов под защитой комбинированного криоконсерванта, содержащего ПДС и ДМАЦ в конечных концентрациях 18,5% и 5% соответственно, который обеспечивает сохранность до 94 ± 3% эритроцитов. В конечном размороженном продукте содержание общего гемоглобина составило 47,1 ± 0,8г, свободного гемоглобина менее 0,69 ± 0,04 г/л. Коэффициент Бора — 0,31 ± 0,003 у. е. Эти показатели свидетельствуют о некотором преимуществе этого метода перед криоконсервированием эритроцитов под защитой ПДС.

В 2007-2011 гг. в РФ (НПО «Синтез») разработаны полимерные контейнеры ККП-500 для замораживания эритроцитов в жидком азоте и при -80 оС, которые прошли доклиническое изучение в ВМедА им. С. М. Кирова. Результаты испытания показали перспективность использования полимерных контейнеров по назначению.

Замораживание тромбоцитов в зарубежных странах практикуется с применением демитилсульфоксида (ДМСО). В ВМедА им С. М. Кирова криоконсервирование концентратов тромбоцитов (КТ) практикуется с 1980 г. с применением криозащитного раствора «Тромбокриод-мац», в состав которого в качестве криофилактика входит диметилацетамид (в 2,5% концентрации). Метод прошел доклиническое и клиническое изучение с отличным результатом. Первоначально замораживанию подвергли КТ, получаемый на аппарате Haemonetics М-30. Температура хранения клеток составляла -196 оС. Всего было заготовлено и перелито с положительным клиническим эффектом более 1000 доз КТ. Количество замораживаемых клеток в одной дозе составляло >250*109 тромбоцитов с раствором «Тромбокриодмац». Замораживание в металлических контейнерах в жидком азоте обеспечивало сохранность 75-80% клеток, при этом их функциональная активность снижалась на 25-35%.

В 1996 г. в НИЛ — Центре крови и тканей ВМедА им. С. М. Кирова разработан метод низкотемпературного консервирования тромбоцитов при -80 оС под защитой 2,5% раствора диметилацетамида. Сопоставление результатов лабораторной оценки результатов свидетельствует о наличии некоторого преимущества метода замораживания тромбоцитов с 5% раствором диметилсульфоксида по отношению к 2,5% раствору ДМАЦ: сохранность клеток — соответственно 74,3±2,9% и 70,23±2,4%; степень агрегации тромбоцитов индуцированный АДФ 17,22±1,06% и 15,5±1,1% соответственно, агристин индуцированный — 30,4±1,3% и 23,97±0,94% соответственно [7].

В настоящее время для замораживания используют КТ аппаратный. Объем КТ составляет 300 мл, количество тромбоцитов — 300*109 в полимерных контейнерах типа «Компопласт», криозащитный раствор «Тром-бокриодмац».

Температура замораживания и хранения -80 оС. Транспортировка в термозащитном контейнере, охлажденном до -80 оС (обеспечивается стабильность температуры на уровне -30 оС в течение 3-х часов), размораживание — непосредственно перед переливанием — в аппарате для размораживания и подогревания компонентов крови. Готовый к переливанию КТ: объем — 180 мл, количество тромбоцитов >190*109 (допустимая величина 120*109), функциональная харак-

теристика: агрегация ристомицином — 31,7%, агрегация АДФ — 15,5%. Доступность запасов 100%. Время реализации заявки 50-75 мин. Клиническое изучение показало достаточную лечебную эффективность метода при условии увеличения в 2-2,5 раза количества переливаемых тромбоцитов на одну трансфузию. Переносимость трансфузий КТ с ДМАЦ существенно лучше, нежели при использовании КТ с ДСМО.

Замораживание клеток костного мозга

В настоящее время для трансплантации больным используют их собственные (аутогенные) стволовые клетки, получаемые путем фракционирования костномозговой взвеси и из периферической крови пациента. Доказана целесообразность резервирования аутогенного костного мозга лиц, чья деятельность связана с высоким риском лучевой травмы [19]. В течение многих десятилетий основным способом сохранения костного мозга было его криоконсервирование 7,5-10% раствора диметилсульфоксида [17, 18]. Опыт работы специалистов ВМедА им. С. М Кирова включает использование криоконсервированного с 7,5% раствором ДМСО костного мозга у 160 пациентов с приживлением его в 100% случаев. Однократный объем получаемой у пациентов костно-мозговой взвеси, приготовленной к замораживанию составляет 310-340 г, абсолютное количество мононуклеаров 5,88*109, CD34+— 560,8*106 клеток. Из костного мозга выделяется 90% мононуклеаров, из концентрата стволовых клеток костного мозга — 94,2%. Показатель сохранности жизнеспособных гемо-поэтических клеток (CD34+, CD45+) после размораживания составляла 93% (костный мозг) и 92% (стволовая клетка периферической крови — СКПК). Используемая нами медицинская технология заготовки и криоконсер-вирования клеток костного мозга и СКПК имеет сходство с такими технологиями, применяемыми в стране и за рубежом, которые считаются «методом выбора». Вместе с этим, мы располагаем значительным опытом использования в качестве криозащитного раствора 3 % раствора ДМАЦ, который обеспечивает морфологическую сохранность 67,5±5% клеток (ДМСО — 66,0±4,0%), колониеобразующую способность: КОС, ед. — 20,0±4 (ДМСО — 19,0±3,5%); КлОС, ед — 47 (ДМСО — 56). Таким образом, в обоих методах после размораживания содержание мононуклеаров не изменялось.

В 1978 г. и 1984 г. метод криоконсервирования клеток костного мозга использован для его резервирования с целью последующего применения для аутотрансплан-тации (в случае возникновения катастрофы или серьезной аварии, сопровождающийся облучением личного состава). Исследования образцов через 33 года показало сохранность 93% замороженных клеток.

Заключение

Разработка отечественных методов низкотемпературного консервирования клеток крови и костного мозга является высокоактуальной научно-практической проблемой, решение которой имеет важное оборонное значение. Накопленный опыт научных и опытно-конс-

трукторских работ в РФ свидетельствует о реальной возможности создания и внедрения в практику высокоэффективных методов получения аллогенных и аутогенных компонентов крови, их резервирование путем замораживания при температуре -150… -196 0С, -65… -80 0С и -25. -40 0С в полимерных контейнерах отечественного производства.

Перспективными криозащитными растворами являются рецептуры на основе глицерина, ПДС, пропиленг-ликоля в сочетании с ДМАЦ (для эритроцитов), ДМАЦ и ДМСО — для тромбоцитов и клеток костного мозга.

Оптимальное решение анализируемой проблемы возможно при ее рассмотрении как общегосударственной задачи. Вместе с этим имеется потенциал для выполнения прикладных исследований на основе разработки и утверждения медицинских технологий для использования в интересах пациентов, пострадавших в чрезвычайных условиях.

Налаживание работ по резервированию компонентов крови и гемопоэтических клеток костного мозга, стволовых клеток периферической крови самым тесным образом связано:

— c внедрением в практику работы ВЛУ современных технологий производственной трансфузиологии;

— c решением вопроса карантинизации всех компонентов крови;

— c расширением перечня антигенов эритроцитов, типирование которых является целесообразным, так как замороженные компоненты могут оказаться единственным источником получения эритроцитного компонента с редковстречающимся набором клинически значимых антигенов;

— c необходимостью расширения перечня типиру-емых в обязательном порядке маркеров гемотрансмис-сивных вирусных инфекций, приобретающих актуальность для пациентов с тяжелыми иммунодефицитными состояниями;

— c решением организационных вопросов планового аутодонорства среди групп населения, чья профессиональная деятельность связана с высоким риском серьезных (тяжелых) повреждений, лечение которых предопределяет необходимость использования аутоге-мотрансфузий.

Список литературы

1. Чиж И. М. Военная медицина и медицина катастроф. // Военно-медицинский журнал. 2010. Т. СССХХХ1, № 9, 17 с.

2. Сидоркевич С. В. Совершенствование производственной деятельности службы крови ВС РФ в мирное время: дисс. докт. мед. наук. — СПб., ВМедА им. С. М. Кирова. 2002. — 566 с.

3. Valeri C. R. et al. An integrated Liguit — Frozen Blood Bauking System. // Vox. Sangvinis, Basel, 1983, vol. 45/1, p. 2539.

4. Lelkens Ch. stuiy j. New missions, renewed attention for blood supply// International review of the armed forus medical services. 1995. Vol. LXVIII, № 4/5/6. — p. 120-123.

5. Blood program NATO, 1985.

6. Калеко С. П., Сидоркевич С. В., Петренко Г. И., Виль-янинов В. Н., Багаутдинов Ш. М. Замораживание эритроцитов до -80 0С под защитой пропиленгликоля и диметилацетомида. // Трансфузиология. 2001. № 3.

7. Захаров В. В. Консервирование тромбоцитов замораживанием до -80°С под защитой диметилацетомида. — СПб., 1996. 115 с.

8. Калеко С. П., Петренко Г. И., Агеев А. К., Багаут-динов Ш. М. Эффективность трансплантаций костного мозга, криоконсервированного с ДМАЦ в эксперименте // Матер. II Украинского съезда гематологов и трансфузиологов. — Киев, 1986. 39с.

9. Чечеткин А. В., Пелешок С. А., Багаутдинов Ш. М. и др. Криоконсервирование клеток крови в полимерных контейнерах на станциях (в отделениях) переливания крови военных лечебных учреждениях // Метод. рек. — М., 2012. — 27 с.

10. Пушкарь Н. С. Физико-химические основы метода низкотемпературной консервации биологических объектов. Механизмы криоповреждения и криопротекции биологических структур (Сб. матер. семинара, Харьков, 1974). — Киев, 1976. — 160 с.

11. Мегутап Н. Т., Horublower M. A method for freezing and washing RBCs using a high glycerol concentration. // Transfusion. 1972. No 12. P. 145-156.

12. Селиванов Е. А., Чечеткин А. В., Григорьян М. Ш., Макеев А. Б. Состояния и перспективы развития криоконсерви-рования эритроцитов в службе крови РФ // Трансфузиология. 2012. № 2, (Т. 13). С. 14-20.

13. Инструкция по криоконсервированию клеток крови. — М., 1995. — 41 с.

14. Valeri C. R., Rango G., PrivacekL. E. An experiment with glyceral-frozen red blood cells stored at 800С in excess at -800С degress C up to 37 years // Vox Sang. 2000. Vol. 79. № 3. P. 168-174.

15. Jung O. J., Kim M. J., Chung H. R. et al. The cryopreservation anol thawing of red blood cells using halmonetics ASP 215 // Vox Sang. 2005. Vol. 89, Suppl I.-p. 171.

16. Технический регламент о требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии. Утв. постановлением Правительства РФот 26 01. 2010 г., № 29.

17. Холодный А. Я., Филев Л. В., Турбина И. Л. и др. Кри-оконсервирование костного мозга доноров с использованием криопротектора ДМАЦ // Труды ВМА, 1986. Т. 222. С. 34-40.

18. Стандартизация производства, применения и контроля качества криоконсервирующих, отмывающих и ресуспен-дирующих растворов в военно-медицинских учреждениях // Метод. рек. — М., 2010. — 55 с.

19. Селиванов Е. А. Белов Е. В., Данилова Т. Н. Состояние и перспективы развития производственной трансфузиологии в России // Проблемы гематологии и переливания крови. 1998. № 4. С. 26-28.

20. Багаутдинов Ш. М., Вильянинов В. Н., Ващенко В. И. и др. Влияние глубокого замораживания на клеточную структуру эритроцитов человека. // Вестник Международной академии холода. 2014. № 2. С. 41-44.

References

1. Chizh I. M. Military medicine and medicine of catastrophes. Voenno-meditsinskii zhurnal. 2010. T. CCCXXXI, No 9, p. 17. (in Russian)

2. Sidorkevich S. V. Enhancement of a production activity of service of blood of Russian Armed Forces in a peace time. St. Petersburg, 2002. 566 p. (in Russian)

3. Valeri C. R. et al. An integrated Liguit — Frozen Blood Bauking System. Vox. Sangvinis, Basel, 1983, vol. 45/1, p. 25-39.

4. Lelkens Ch. stuiy j. New missions, renewed attention for blood supply. International review of the armed forus medical services. 1995. Vol. LXVIII, № 4/5/6. — p. 120-123.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

5. Blood program NATO, 1985.

6. Kaleko S. P., Sidorkevich S. V. et al. Freezing of erythrocytes to-80 0C under protection of propylene glycol and a dime-tilatsetomid. Transfusiology. 2001. No 3. (in Russian)

7. Zakharov V. V. Conservation of platelets freezing to -80oC under protection of a dimetilatsetomid. St. Petersburg, 1996. 115 p. (in Russian)

8. Kaleko S. P., Petrenko G. I. et al. Effektivnost of transplantations of the marrow cryopreserved with DMATs in experiment. Materials II of the Ukrainian congress of hematologists and transfuziolog. — Kiev, 1986. 39p. (in Russian)

9. Chechetkin A. V., Peleshok S. A., Bagautdinov Sh. M. etc. Kriokonservirovaniye of blood cells in polymeric containers at stations (in separations) blood transfusions military medical institutions. — Moscow, 2012. 27 p. (in Russian)

10. Pushkar N. S. Physical and chemical bases of a method of the low-temperature conservation of biological objects. Mechanisms of cryodamage and cryoprotection of biological structures. Kiev, 1976. 160 p. (in Russian)

11. Meryman Н. Т., Horublower M. A method for freezing and washing RBCs using a high glycerol concentration. Transfusion. 1972. No 12. P. 145-156.

12. Selivanov E. A., Chechetkin A. V. et al. Statuses and perspectives of development of cryoconservation of erythrocytes in service of Russian Federation blood. Transfusiology. 2012. No. 2, (T. 13). P. 14-20. (in Russian)

13. Instruction on cryoconservation of blood cells. Moscow, 1995. 41 p.

14. Valeri C. R., Rango G., Privacek L. E. An experiment with glyceral-frozen red blood cells stored at 800С in excess at -800С degress C up to 37 years. Vox Sang. 2000. Vol. 79. No 3. P. 168-174.

15. Jung O. J., Kim M. J., Chung H. R. et al. The cryopreservation anol thawing of red blood cells using halmonetics ASP 215. Vox Sang. 2005. Vol. 89, Suppl I.-p. 171.

16. The technical rules about safety requirements of blood, its products, the krovezameshchayushchikh of the solutions and technical means used in transfusion and infusional therapy. 2010. No. 29. (in Russian)

17. Kholodnyi A. Ya., Filev L. V., Turbina I. L. Kriokonser-virovaniye of marrow of donors with use of a cryoprotector of DMATs. 1986. T. 222. P. 34-40. (in Russian)

18. Standardization of production, the application and quality control cryopreserving, washing and the resuspendiruyush-chikh of solutions in military-medical establishments. Moscow, 2010. 55 p. (in Russian)

19. Selivanov E. A. Belov E. V., Danilova T. N. Perspective of development of production transfusiology in Russia. Problemy gematologii i perelivaniya krovi. 1998. No 4. p. 26-28. (in Russian)

20. Bagautdinov Sh. M., Vilyaninov V. N., Vashchenko V. I. et al. Influence of deep freezing on cellular structure of the human red blood cells. VestnikMezhdunarodnoi akademii kholoda. 2014. No 2. p. 41-44. (in Russian)