Галерия мелонелла инструкция по применению отзывы

Галлерия Мелонелла (огнёвка) Здравница: инструкция и применение

Восковая моль — это единственное на земле живое существо, личинки которого способны переваривать и усваивать пчелиный воск. Помимо основной своей пищи — воска, личинки употребляют в пищу цветочную пыльцу, пергу, восковую сушь, мед в сотах, прополис, маточное молочко, хитин пчелы.

Поэтому она обладает кумулятивным (накопительным) свойством в отношении биологически активных продуктов пчеловодства (БАП). Первые исторические сведения об использовании личинок «золотой бабочки» в медицинских целях восходят к античным временам Древней Греции, Египта, Месопотамии. В данном случае личинке Galleria melonella пристальное внимание уделял лауреат Нобелевской премии великий русский ученый И. И. Мечников (премия вручена за открытие и обоснование фагоцитарной теории иммунитета в 1908 году), который в конце XIX века пытался изобрести эффективное противотуберкулезное средство.

Много сил и энергии изучению экстракта личинок восковой моли отдал С. А. Мухин, излечившийся им от туберкулеза. в 1961 году.
Около 7 лет назад в г. Барнауле исследовательская группа (руководитель Г. В. Якубко) разработала и наладила производство экстракта из личинок «Galleria melonella» в виде биологически активной добавки.

Личинок большой восковой моли выращивают по оригинальной методике (Г.В. Якубко). Во время максимальной активности роста личинок материал подвергается сложной многоступенчатой обработке с экстракцией действующих веществ и получением готового продукта. Такая методика предполагает максимально полное и длительное сохранение фармакологической активности препарата.

Состав экстракта содержит: ферменты, нуклеотиды, нуклеозиды, высокомолекулярные белки, пептиды, ксантин и гипоксантин, серотониноподобные вещества, значительное количество микроэлементов, витамины, 20 из 28 свободных аминокислот, (в том числе 9-незаменимых аминокислот), липиды и высшие жирные кислоты (в том числе незаменимые — линолевая и линоленовая).
Установлена выраженная стимуляция поглотительной и переваривающей способности клеток защиты — макро- и микрофагов, а также стимуляция продукции гуморальных факторов иммунитета. Нормализуется содержание иммуноглобулинов G и М и циркулирующих иммунных комплексов.

Обнаружено антиоксидантное действие, которое обеспечивается аминокислотами — цистеином и метионином. Они входят в состав антиоксидантных ферментов — метионинпироксидазы, глютатионпироксидазы и белка глютатиона, препятствующих перекисному окислению липидов и макромолекул организма. Это свойство препятствует стрессорному повреждению тканей и развитию атеросклероза, благодаря чему препарат эффективен как кардиопротекторное средство для профилактики и вспомогательного лечения ИБС.

Препарат содержит фермент сериновую протеазу, который обладает мощным лизирущим эффектом. Экстракт является антибактериальным и противовирусным препаратом широкого спектра действия. Установлена бактерицидная активность препарата.

Противовирусная защита организма обусловлена аминокислотой лизином и биофлавоноидами. Аминокислоты — гистидин и метионин защищают организм от ионизирующей радиации и интоксикации. Благодаря наличию пальмитиновой, линолевой и линоленовой кислот, экстракт обладает антиандрогенным действием.

Таким образом, Galleria melonella — перспективный продукт пчеловодства для укрепления и оздоровления организма человека. Не имеет противопоказаний к применению; не вызывает выраженных проявлений аллергии и других побочных реакций.

• Состав
  
  настойка личинок восковой моли

• Способ применения
  

  Употреблять по 1-й капле (при тяжести заболевания по 3 капли) на 10 кг массы тела 2 раза в день за 30 минут до еды п оформуле: 21 день пить — 7 дней перерыв, 21 день пить — 14 дней перерыв, 21 день пить — 21 день перерыв.

  Рекомендуется цикл 2 раза в год — весна и осень.

• Срок годности
  
  2 года

• Упаковка
  
  стекло

• Форма выпуска
  
  жидкость

Ищите где купить Галлерия Мелонелла (огнёвка)?

Вы можете приобрести Галлерия Мелонелла (огнёвка) по выгодной цене в интернет-аптеке Здравница.

Оформить заказ легко — укажите необходимое количество товара и нажмите кнопку «В корзину» или позвоните по бесплатному номеру 8-800-302-1165. Наши менеджеры также примут у вас заказ в онлайн-чате, Telegram или WhatsApp.

Получить заказ вы можете в пункте выдаче заказов, в отделении почты или же его доставят на указанный вами адрес.

Оплата возможна при получении или непосредственно на сайте в момент оформления заказа. По предопате мы предоставляем скидку на продукцию.

Ознакомьтесь с инструкцией по применению, прочтите отзывы и если возникнут вопросы — наши консультанты с радостью на них ответят в чате или по телефону.

Мы гарантируем подлинность продукта, так как работаем напрямую с производителем Здравница. Это позволяет нам деражть низкий уровень цен и высокое качество обслуживания.

Галерия мелонелла (настойка восковой моли)

— уникальное природное средство, обладающее иммуномодулирующим и иммуностимулирующим действием широчайшего спектра применения.

Показания к применению:

• туберкулез (заживление туберкулезной каверны, отхаркивающее, разжижающие мокроту действие) бронхиальная астма, бронхит, пневмония, респираторные заболевания, грипп;
• сахарный диабет (снижение уровня сахара);
• атеросклероз (предотвращение отложения жиров в печени и стенках кровеносных сосудов, снижение уровня холестерина);
• профилактика и вспомогательное лечение ИСБ, гипертонии (устойчивое снижение артериального давления на 12-14% к 10 дню приема);
• обширные воспалительные процессы, нагноения, оперативные вмешательства (препятствует образованию спаек и рубцов, излечивает свежие рубцы миокарда);
• радиация и интоксикация (выводит соли тяжелых металлов и токсины);
• аденома простаты
• увеличение выносливости и скорости восстановления мышц после тяжелой нагрузки;
• усвоение кальция, увеличение синтеза гемоглобина;
• установлен положительный психотропный эффект повышения настроения, улучшения памяти и способности к обучению, улучшение качества сна;
• лечение алкоголизма;
• эффективен при лечении глазных болезней, катаракты, глаукомы;
• при различных паразитарных инвазиях (лямблии, описторхии, плоские и круглые черви).

Для наружного применения:

Учитывая богатый минеральный состав настойки восковой моли, его активную ферментную составляющую, способную активно снимать отек, воспаление, подкожное, внутреннее кровоизлияние, нормализацию кровотока в микроциркуляторном русле, стабилизацию минерального обмена и, как следствие, улучшение проницаемости стенок сосудов, артериолы, был сделан вывод об эффективности наружного применения препарата. При наружном применении обладает противовоспалительным, анальгетическим, антисептическим, трофическим и ранозаживляющим действием. Показан при остеохондрозах, артритах, воспалении околосуставных тканей, артрозах, невралгии, миалгии, тромбофлебите, псориазе, фурункулезе, герпесе, трофических язвах, пролежнях, ранах, ушибах, растяжениях, послеоперационных швах.

Косметология:

Создает и поддерживает идеальное увлажнение, обеспечивает эластичность кожи и хороший цвет лица, предохраняет ее от преждевременного старения, защищает от вредного воздействия атмосферных явлений, снимает раздражение, зуд (в том числе после укусов насекомых), заживляет мелкие ранки, рекомендуется после бритья.

Рекомендации по применению:

Употреблять по 1-ой капле на 10 кг массы тела 2 раза в день за 30 минут до еды по формуле: 21 день пить — 7 дней перерыв, 21 день пить -14 дней перерыв, 21 день пить — 21 день перерыв.

Рекомендованный цикл 2 раза в год — весна и осень.

Хранить в сухом, защищенном от света месте, при t не выше +25°С.

Срок годности 2 года.

Дата изготовления указана на упаковке.

Не является лекарством!

Имеются противопоказания. Посоветуйтесь с врачом.

Настойка восковой моли — перспективный продукт пчеловодства для укрепления и оздоровления организма человека. Не имеет противопоказаний к применению, не вызывает выраженных проявлений аллергии и других побочных реакций.

Galleria Melonella, Большая восковая моль — источник здоровья и долголетия.

Восковая моль — это единственное на земле существо, личинки которого способны переваривать и усваивать пчелиный воск. Помимо основной своей пищи — воска, личинки употребляют в пищу цветочную пыльцу, пергу, восковую сушь, мед в сотах, прополис, маточное молочко, хитин пчелы. Поэтому она обладает кумулятивным (накопительным) свойством в отношении биологически активных продуктов пчеловодства (БАП). Первые исторические сведения об использовании личинок «золотой бабочки” в медицинских целях восходят к античным временам Древней Греции, Египта, Месопотамии. В данном случае личинке Galleria Melonella пристальное внимание уделял лауреат Нобелевской премии великий русский ученый И. И. Мечников (премия вручена за открытие и обоснование фагоцитарной теории иммунитета в 1908 году), который в конце XIX века пытался изобрести эффективное противотуберкулезное средство. Много сил и энергии изучению экстракта личинок восковой моли отдал С. А. Мухин, излечившийся им от туберкулеза в 1961 году.

Около 7 лет назад в г. Барнауле исследовательская группа (руководитель Г. В. Якубко) разработала и наладила производство экстракта из личинок восковой моли в виде биологически активной добавки. Личинок большой восковой моли выращивают по оригинальной методике (Г. В. Якубко). Во время максимальной активности роста личинок материал подвергается сложной многоступенчатой обработке с экстракцией действующих веществ и получением готового продукта. Такая методика предполагает максимально полное и длительное сохранение фармакологической активности препарата.

Состав экстракта содержит: ферменты, нуклеотиды, нуклеозиды, высокомолекулярные белки, пептиды, ксантин и гипоксантин, серотониноподобные вещества, значительное количество микроэлементов, витамины,20 из 28 свободных аминокислот, (в том числе 9-независимых аминокислот), липиды и высшие жирные кислоты (в том числе незаменимые — линолевую и линоленовую). Установлена выраженная стимуляция поглотительной и переваривающей способности клеток защиты — макро и микрофагом, а также стимуляции продукции гуморальных факторов иммунитета. Нормализуется содержание иммуноглобулинов G и М и циркулирующих иммунных комплексов.

Обнаружено антиоксидантное действие, которое обеспечивается аминокислотами — цистеином и метионином. Они входят в состав антиоксидантных ферментов — метионинпироксидазы, глютатионпироксидазы и белка глютатиона, препятствующих перексиному окислению липидов и макромолекул организма. Это свойство препятствует стрессорному повреждению тканей и развитию атеросклероза, благодаря чему препарат эффективен как кардиопротекторное средство для профилактике и вспомогательного лечения ИБС. Препарат содержит фермент сериновую протеазу, который обладает мощным лизирущим эффектом. Экстракт является антибактериальным и противовирусным препаратом широкого спектра действия. Установлена бактерицидная активность препарата.

Противовирусная защита организма обусловлена аминокислотой лизином и биофлавоноидами. Аминокислоты — гистидин и метионин защищает организм от ионизирующей радиации и интоксикации. Благодаря наличию пальмитиновой, линолевой, линоленовой кислот, экстракт обладает антиандрогенным действием.

Настойка восковой моли: целебные свойства, противопоказания

Личинки восковой моли (галерия мелонелла) считаются ценным побочным продуктом пчеловодства. На их основе готовят уникальное средство – экстракт Мухина. С его помощью лечат различные заболевания, включая такие тяжелые, как туберкулез. Приобрести настойку восковой моли можно в интернет магазине honey-space.ru, где продается качественный, на 100% настоящий алтайский продукт.

Галерия мелонелла: гроза пчел или спасительница людей?

Личинка восковой моли – это гусеница бабочки-огневки (восковой моли). Бабочка обычно живет рядом с пасеками и летит откладывать яйца в ульи. Из яиц появляются гусеницы, поедающие пчелиный воск. Они прогрызают соты, выделяют продукты распада в мед и оплетают все в улье паутиной. Экскременты личинок имеют черный цвет и неприятный запах. За небольшое время гусеницы уничтожают все соты, обрекая на гибель от голода как личинок пчел, так и взрослых насекомых. Но при этом они единственные в мире насекомые, способные перерабатывать воск. Это свойство открыл знаменитый русский ученый-биолог и геронтолог И. Мечников. Он выяснил, что входящий в состав желудочного сока личинки огневки церраза полностью растворяет жировосковую оболочку бактерий туберкулеза, уничтожая их всего за 2-3 дня.

Эксперименты продолжил его ученик – С. Метальников, а с 1984 по 1991 – гомеопат Сергей Мухин. Он доказал, что свойства экстракта благотворно влияют на сердечно-сосудистую систему и другие системы организма человека. Именно Мухин разработал уникальный состав спиртовой настойки на личинках моли, которая стала очень популярным гомеопатическим средством.

От чего помогает настойка восковой моли?

Экстракт Меланиум официальная медицина не признает, считая, что его воздействие – это эффект плацебо (самовнушение). Но в народной медицине настойка личинок очень востребована. Судя по результатам и отзывам, это действеннее средство для лечения:

1. Туберкулеза, а также бронхитов, астмы, пневмонии.
2. Сердечно-сосудистых заболеваний (стенокардия, аритмия, инфаркт миокарда, повышенное давление, тромбофлебит, варикозное расширение вен).
3. Воспалений и рубцов, вызванных оперативным вмешательством.
4. Анемии.
5. Болезней печени, поджелудочной железы, желудка.
6. Бесплодия, некоторых женских болезней, в том числе раннего климакса.
7. Простатита, импотенции, мужского бесплодия.
8. Воспаление мочеполовой системы.
9. Кожных заболеваний (угревая сыпь, фурункулы, чирьи, псориаз и др.).
10. Заболевания сустав (артрозы, артриты).

Помимо этого, настойка личинок повышает иммунитет, нормализует обменные процессы в тканях и органах, повышает физическую выносливость и умственную активность. Она помогает очистить сосуды от холестерина, понижает уровень сахара в крови. Этот натуральный продукт считается хорошим средством для выведения из организма солей тяжелых металлов и токсинов. Например, с его помощью снимают симптомы тяжелого алкогольного отравления.

Кому не стоит принимать Меланиум

Из-за мощного воздействия на все системы организма, экстракт личинок восковой моли нельзя пить беременным женщинам и детям младше 14 лет. Категорически запрещено употреблять ее людям с аллергией на продукты пчеловодства. Всем остальным перед применением Меланиума надо обязательно проконсультироваться с хорошим врачом – при некоторых заболеваниях настойку принимать следует очень осторожно, либо вовсе избегать лечения с ее помощью.

Также по теме:

В последние годы в качестве альтернативной модели для изучения бактериальных инфекций, а также для оценки эффективности антибактериальных препаратов широко используют Galleria mellonella — личинки большой восковой моли. Преимущества данной модельной системы — отсутствие биоэтических ограничений, возможности использования большого количества животных в эксперименте, короткий жизненный цикл. Личинки могут расти при широком температурном диапазоне (18–37 °C), что позволяет исследовать на данной модели патогены человека, которым в большинстве случаев необходима инкубация при 37 °C. Несмотря на отсутствие у насекомых приобретенного иммунитета, врожденный иммунитет восковой моли имеет значительное сходство с иммунным ответом позвоночных животных, в том числе и человека.

Цель работы — разработка модели бактериальной инфекции личинок большой восковой моли, включающая сравнительную оценку как эффективности заражения личинок эталонными штаммами микроорганизмов и их клиническими изолятами, так и применения препаратов Рифампицин (ПАО «Красфарма», Россия) и Ципрофлоксацин (Эльфа Лабораториз, Индия) на инфицированных личинках.

Данное исследование предусматривало три последовательных этапа, на I этапе проводили сравнительную оценку вирулентности эталонных штаммов Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli и их клинических изолятов, а также определяли инфекционную дозу бактериальной суспензии для инъекции личинкам. Таким образом, было установлено, что исследуемые клинические изоляты St. aureus, Str. pneumoniae и E. coli оказались более вирулентными относительно эталонных штаммов микроорганизмов.

На II этапе исследования определяли минимально подавляющую концентрацию in vitro для каждого штамма микроорганизма, что позволяло определить чувствительность штаммов к исследуемым антибиотикам, а именно ципрофлоксацину и рифампицину.

На III этапе после заражения личинок инфекционной дозой была проведена антибактериальная терапия, при этом полученные результаты подтвердили данные II этапа in vitro. Наблюдали гибель личинок, зараженных резистентными штаммами St. aureus и E. coli к ципрофлоксацину и рифампицину соответственно.

Данная модель характеризовалась изменением общего состояния личинок (меланизация, подвижность, образование кокона) и гибелью животных в зависимости от концентрации микроорганизмов в инокулюме. Продемонстрировано, на сколько данная модель применима для оценки чувствительности бактерий к антибиотикам на примере ципрофлоксацина и рифампицина.

Введение

Доклинические исследования эффективности и безопасности лекарственных средств проводят с использованием лабораторных животных, обеспечивающих возможность переносить полученные результаты на человека. В качестве таких тест-систем наиболее часто используют грызунов — мышей, крыс. Однако при проведении исследований на животных необходимо учитывать этические принципы и большую стоимость данных разработок.

Помимо стандартных моделей исследований с применением лабораторных грызунов существуют альтернативные модели, использующие в качестве тест-системы беспозвоночных животных. Данные модели не могут полностью заменить исследования на млекопитающих, но они применяются в качестве дополнительных для расширения знаний о бактериальном патогенезе, изучения вирулентности микроорганизмов, а также открытия новых антибактериальных соединений.

Для изучения бактериальных инфекций, а также для оценки эффективности антибактериальных препаратов широко используются личинки большой восковой моли [1]. Большая восковая моль Galleria mellonella — один из традиционных объектов лабораторных исследований [2]. Отсутствие биоэтических ограничений и возможность применения большого количества личинок в эксперименте позволяют большой восковой моли быть модельным объектом в следующих тестах:
1) определение микробной вирулентности и патогенности микроорганизмов;
2) определение ЛД₅₀ (среднелетальная доза) вещества;
3) фармакокинетика;
4) тестирование эффективности противомик­робных средств на зараженных личинках.

Несмотря на отсутствие у насекомых приобретенного иммунитета, врожденный иммунитет восковой моли имеет значительное сходство с иммунным ответом позвоночных животных, в том числе и человека [3]. Эти характеристики делают G. mellonella удобным объектом для оценки вирулентности бактерий, а также исследований на чувствительность к антибиотикам, в частности, штаммов Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae и Escherichia coli [4, 5].

Цель данного исследования — разработка модели бактериальной инфекции личинок большой восковой моли, включающая сравнительную оценку эффективности не только заражения личинок эталонными штаммами микроорганизмов и их клиническими изолятами, но и применения препаратов Рифампицин (ПАО «Красфарма», Россия) и Ципрофлоксацин (Эльфа Лабораториз, Индия) на инфицированных личинках.

Материал и методы

Личинки большой восковой моли

В качестве биологической тест-системы использовали личинки большой восковой моли G. mellonella. В исследование отбирали личинки в возрасте 5 нед, массой 200–300 мг. Личинки большой восковой моли до начала эксперимента содержали на искусственном субстрате (22% кукурузной муки, 22% зародышей пшеницы, 11% сухих дрожжей, 17,5% пчелиного воска, 11% меда и 11% глицерина) при температуре 2–8 °C в затемненных контейнерах для замедления созревания и перехода в стадию куколки [6]. После заражения личинки помещали в чашках Петри без субстрата, затем — в термостат при температуре 37 °C на 5 сут [7]. Распределение животных на группы по 10 личинок в каждой проводили методом слепой рандомизации [8]. Исследование выполняли в соответствии с принципами 3Rs, то есть осуществили замену лабораторных животных на альтернативную модель более низкой филогенетической группы. Проведение исследования было одобрено экспертной комиссией (ЭК) АО НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ» (протокол ЭК № 8/21).

Микроорганизмы

В качестве инфекционных агентов были выбраны эталонные штаммы микроорганизмов из Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, ATCC): E. coli ATCC 25922 (ВКПМ В-8076), St. aureus ATCC 29213, Str. pneumoniaе ATCC 6303, а также их клинические изоляты: E. coli ENV 194, St. aureus SA 0077 (MRSA), Str. pneumoniaе 1068 19 А. Музейные тест-штаммы и клинические изоляты, используемые в исследовании перед началом эксперимента, были активированы высевом в гидролизат говяжьего мяса ферментативного (ГМФ-бульон) с последующим пересевом на соответствующий питательный агар: ГМФ-агар, колумбийский агар.

Определение инфекционной дозы

Заражение штаммами E. coli, Str. pneumoniaе, St. aureus проводили в 1‑й день эксперимента путем введения бактериального инокулюма в гемоцель через последнюю левую ложноножку с помощью микрошприца Hamilton (Hamilton, СШA) 10 мкл [9]. Для удобства введения инокулюма личинки были обездвижены путем помещения на 15 мин в холодильную камеру при температуре 2–8 °С. Для создания оптимальных условий развития патогена после заражения личинки содержали в термостате при температуре 37 °C [6, 9]. Инфекционная доза определялась как доза, вызывающая иммунный ответ, распознаваемый по потемнению кутикулы, а также 60–80% летальность [9].

Регистрация показателей здоровья личинок

Для оценки заражения штаммами микроорганизмов проводили учет показателей здоровья личинок (в соответствии с табл. 1 и рис. 1). Было оценено состояние здоровья личинок путем присвоения баллов по 4 основным показателям: подвижность личинок, образование коконов, меланизация и выживаемость [7]. При оценке подвижности личинки использовали в качестве стимула стерильные одноразовые петли.

Личинки признавали мертвыми, если они не проявляли реакции (движений) на прикосновение. Оценку выживаемости проводили методом построения кривой Каплана–Мейера. Летальность и учет показателей здоровья личинок оценивали каждые 24 ч [6, 7, 10, 11].

Определение антимикробной активности in vitro

На данном этапе исследования определяли чувствительность используемых штаммов микроорганизмов к рифампицину и ципрофлоксацину in vitro для дальнейшего исследования эффективности лечения данными препаратами инфицированных личинок. Определение антимикробной активности исследуемых объектов проводили методом микроразведений в планшетах с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК). Для метода микроразведений грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов использовали бульон Мюллера–Хинтона [12], для микроорганизма Str. pneumoniae — бульон Мюллера–Хинтона с добавлением 5% лизированной бараньей крови [13, 14].

На данном этапе изучали тестируемые объекты ципрофлоксацин и рифампицин. Рифампицин активен в отношении грамположительных микроорганизмов Streptococcus spp. и Staphylococcus spp., а также является стандартным средством лечения метициллинрезистентного стафилококка (S. aureus MRSA). Однако по отношению к грамотрицательным микроорганизмам E. coli рифампицин менее активен. К ципрофлоксацину чувствительны грамотрицательные аэробные микроорганизмы E. coli, также он активен в отношении грамположительных микроорганизмов Streptococcus spp. и Staphylococcus spp. Однако большинство стафилококков, устойчивых к метициллину (S. aureus MRSA), резистентны к ципрофлоксацину [15, 16].

Приготовление рабочих растворов исследуемых объектов осуществляли с использованием бульона Мюллера–Хинтона. Были изучены концентрации от 0,007 до 512 мкг/мл. Планшеты инкубировали при температуре 34–37 °С в течение 18±2 ч [12]. После инкубации визуально оценивали наличие или отсутствие роста микроорганизмов в лунках планшетов. МПК исследуемых объектов соответствовала лунка с наименьшей концентрацией исследуемых объектов без признаков видимого роста тест-микроорганизмов.

Антибактериальная терапия инфицированных личинок

Личинок большой восковой моли заражали инфекционной дозой, установленной на I этапе эксперимента в последнюю левую ложноножку, затем инкубировали в термостате при температуре 37 °C. Через 2 ч вводили тестируемые препараты в последнюю правую ложноножку и продолжали инкубацию.

Согласно инструкции по медицинскому применению (ИМП) препарата Рифампицин в виде лиофилизата для приготовления раствора для инфузий (150 мг) [15], максимальная суточная доза 600 мг, что при пересчете на 1 кг массы тела взрослого человека составляет:

Терапевтическая доза = 600 мг/60 кг (средняя масса тела человека) = 10 мг/кг.

Терапевтическая доза (ТД) ципрофлоксацина, согласно инструкции по медицинскому применению, также равна 10 мг/кг [16].

Расчет концентрации (С) инъекции антибиотика проводили по формуле:

C_{инъекции} = (C_in vivo×V_{личинки})/V_{инъекции},

где C_{инъекции} — концентрация тестируемого объекта в инъекции; C_in vivo — концентрация тестируемого объекта в личинке; V_{личинки} — объем личинки, V_{личинки}=0,3 мл; V_{инъекции} — объем инъекции, V_{инъекции}=10 мкл.

При перерасчете концентрации ципрофлоксацина на личинку с учетом отношения массы гемолимфы личинки к ее объему, приблизительно равному единице [17], соответствует:

10 мг/кг = 10 мкг/г = 10 мкг/мл = C_in vivo.

Концентрация вводимого препарата для личинки:

C_{инъекции} = (10 мкг/мл×0,3 мл)/0,01 мл = 300 мкг/мл.

Таким образом, было исследовано 3 дозы: 1/2 ТД; ТД; ТД×2.

В каждой исследуемой группе было по 10 личинок, причем в каждый первый день использовали 3 контрольные группы: интактную, травмированного контроля (нарушение целостности кутикулы, прокалывание иглой) и контрольную с введенным буфером (PBS). Также были добавлены контрольные группы для тестируемых препаратов, чтобы исключить токсическое влияние самих антибиотиков. На протяжении всего III этапа осуществляли регистрацию гибели ежедневно с балльной системой учета показателей здоровья (см. табл. 1).

Эвтаназия

Эвтаназию всех использованных в эксперименте личинок большой восковой моли проводили путем погружения в 70% раствор этилового спирта в последний, 5‑й день эксперимента [18].

Анализ данных

Для данных, полученных на I этапе исследования, был применен анализ выживаемости методом Каплана–Мейера с последующей оценкой межгрупповых различий логранговым тестом Мантела–Кокса с построением кривой выживаемости.

Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05. Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения Prism 9 (GraphPad Software, СШA).

Расчет летальных доз (ЛД₅₀ и ЛД₇₀) проводили с помощью пробит-анализа по Прозоровскому [19].

Результаты и обсуждение

I этап — моделирование патологии

На протяжении всего эксперимента (до заражения, в 1‑й день и далее каждые 24 ч до эвтаназии) проводили учет показателей здоровья личинок (см. табл. 1).

До заражения у личинок всех экспериментальных групп наблюдали активное движение и способность к коконообразованию, меланизация отсутствовала.

При учете показателей здоровья через 24 часа после контрольного укола и введения индукторов патологии в интактной группе не установлено признаков угнетения личинок. Все личинки проявляли умеренную активность с возможностью коконообразования. Меланизация и гибель отсутствовали (рис. 2).

Во всех группах с нарушением целостности покровов регистрировали единичные случаи гибели личинок. В группах с контрольным проколом и с введенным фосфатно-солевым буфером регистрировали гибель одной личинки в каждой группе. Оставшиеся в живых личинки не отличались по своим жизненным показателям от интактных (рис. 3).

В группах, зараженных инокулюмом в более низких концентрациях, наблюдали гибель нескольких личинок (рис. 4). Выжившие личинки были в основном активны, меланизация либо отсутствовала, либо была слабо выражена, способность к коконообразованию сохранилась. С увеличением концентрации инокулюма, смертность в группах значительно возрастала (рис. 5, 6). У оставшихся в живых личинок регистрировали снижение активности, потемнение кутикулы и угнетение способности коконообразования (см. рис. 4). У погибших личинок отмечали полное почернение покровов тела (рис. 7).

Для оценки вирулентности штаммов было принято решение рассчитать летальные дозы с использованием пробит-анализа по Прозоровскому (табл. 2).

Исходя из полученных значений ЛД₅₀, можно сделать заключение, что клинические изоляты являются более вирулентными относительно соответствующих эталонных штаммов.

Для заражения и дальнейшего лечения личинок большой восковой моли была установлена инфекционная доза. За инфекционную дозу бактерий приняли дозу, вызывающую 60–80% летальность. Исходя из расчетов летальной дозы (ЛД₇₀), были выбраны дозы для инфицирования и дальнейшей антибактериальной терапии личинок на III этапе исследования.

II этап — определение МПК

Через 18 ч после инкубации планшетов оценивали антимикробную активность рифампицина и ципрофлоксацина в отношении используемых штаммов микроорганизмов. Для подтверждения вносимого количества клеток микроорганизмов в лунки планшетов в день постановки теста проводили высев содержимого лунки на чашки Петри. Контроль посевной дозы подтвердил необходимое количество клеток, вносимых в лунки планшетов, для бактерий в диапазоне 2×10⁵–8×10⁵ КОЕ/мл [13].

Также вместе с контролями посевных доз проводили учет результатов с 96‑луночных планшетов. Результаты учитывали визуально в проходящем свете. Данные оценки антимикробной активности сравнивали со значениями ECOFF (Epidemiological cut-off value, эпидемиологическое пороговое значение), представленными EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Европейский комитет по тестированию чувствительности к антимикробным препаратам), полученные сведения отображены в табл. 3.

При сравнении полученных значений МПК и ECOFF можно сделать выводы о чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

Клинический изолят S. aureus SA0077 по паспорту является метициллинрезистентным золотистым стафилококком (MRSA) соответственно, штамм оказался устойчивым к ципрофлоксацину и чувствительным к рифампицину. Эталонный штамм S. aureus ATCC 29213 также чувствителен к рифампицину и начал вырабатывать устойчивость к ципрофлоксацину. Str. pneumoniae, эталонный штамм и клинический изолят оказались оба чувствительными к исследуемым антибиотикам. E. coli, как и ожидалось, был чувствителен к ципрофлоксацину и устойчив к рифампицину.

III этап — антибактериальная терапия

На III этапе исследования проверяли работу антибиотиков in vivo, заражали личинок большой восковой моли инфекционной дозой, а затем осуществляли антибактериальную терапию. При этом, как и на I этапе, проводили учет показателей здоровья личинок до заражения, в 1‑й день и далее каждые 24 ч. До заражения все личинки были активны и способны к коконообразованию, меланизация отсутствовала.

В 1‑й день эксперимента заражали личинок большой восковой моли соответствующими инфекционными дозами для каждого исследуемого штамма. Расчетные и фактически полученные концентрации инокулюмов представлены в табл. 4.

Концентрация инокулюма у штаммов Str. pneumoniae ATCC 6303, Str. pneumoniae 1068 19A, E. coli ENV 194 превысила расчетные концентрации на порядок, однако антибактериальная терапия все же оказалась эффективной относительно негативного контроля — инфицированных личинок без лечения.

При учете показателей здоровья через 24 ч после контрольного укола и введения индукторов патологии в контрольных группах не установлено признаков угнетения личинок. Все личинки проявляли умеренную активность с возможностью коконообразования. Меланизация и гибель отсутствовали, за исключением гибели одной личинки в группе контрольного прокола. Сумма баллов при оценке показателей здоровья в течение 5 дней наблюдения не была ниже 87,5. Также в группах контроля токсичности антибиотика гибель не зарегистрирована, личинки чувствовали себя хорошо — сумма баллов здоровья не ниже 91 из 100. В негативном контроле (зараженные личинки без лечения) регистрировали значительную гибель, потемнение кутикулы и снижение активности.

Как и ожидалось по результатам исследования in vitro, ципрофлоксацин оказался неэффективным, а рифампицин был действенным во всех концентрациях относительно микроорганизма St. aureus. Рифампицин in vivo чуть лучше воздействовал на инфекцию, вызванную эталонным штаммом St. aureus ATCC 29213, чем клиническим изолятом SA 0077. Оценка (в баллах) здоровья личинок, получавших антибактериальную терапию рифампицином, была значительно выше, чем в негативном контроле, что подтверждает действие антибиотика по отношению к штамму St. aureus SA 0077 (рис. 8).

Штаммы Str. pneumoniae оказались чувствительны по отношению к исследуемым антибиотикам во всех концентрациях. Установлено, что на уровень здоровья личинок эталонный штамм Str. pneumoniae ATCC 6303 и клинический изолят Str. pneumoniae 1068 19A влияли одинаково (рис. 9).

Из II этапа следует, что штамм E. coli устойчив по отношению к рифампмцину, что можно увидеть на графике при оценке уровня здоровья (рис. 10), однако к ципрофлоксацину E. coli был чувствителен во всех концентрациях.

Таким образом, антибактериальная терапия во всех трех исследуемых дозах, рассчитанных исходя из терапевтических, оказалась эффективной. Как и ожидалось, in vivo наблюдали резистентность S. aureus по отношению к ципрофлоксацину, E. coli — к рифампицину.

Заключение

В рамках проведенного эксперимента была разработана модель бактериальной инфекции личинок Galleria mellonella на примере эталонных штаммов Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae и их клинических изолятов. Модель характеризовалась изменением общего состояния личинок (меланизация, подвижность, образование кокона) и гибелью животных в зависимости от дозы микроорганизмов.

Было установлено, что исследуемые клинические изоляты Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae и Escherichia coli оказались более вирулентными относительно эталонных штаммов микроорганизмов при инфицировании личинок Galleria mellonella. Штаммы микроорганизмов, оказавшиеся резистентными к антибиотикам в исследовании in vitro, приводили к гибели личинок на фоне антибактериальной терапии теми же антибиотиками.

Таким образом, совокупность полученных результатов продемонстрировала применимость в качестве модельного объекта личинок Galleria mellonella для оценки эффективности антибактериальных препаратов.