Экстракция 100 инструкция вектор бест

Утверждена

приказом Председателя

Комитета контроля медицинской и

фармацевтической деятельности МЗ и СР РК

от 12 июня 2017 года № 008741

Инструкция

по медицинскому применению изделия медицинского назначения

Название изделия медицинского назначения

Набор реагентов для выделения нуклеиновых кислот из клинических образцов (РеалБест экстракция 100)

Состав и описание изделия

1. Характеристика набора

Принцип метода

Принцип действия набора «РеалБест экстракция 100» состоит в температурной обработке пробы многокомпонентным лизирующим раствором, разрушающим комплекс нуклеиновых кислот с белками, с последующим спиртовым осаждением нуклеиновых кислот на магнитные частицы, спиртовыми отмывками и последующей элюцией. После этого проба готова к постановке реакции ПЦР или ОТ-ПЦР.

Принцип анализа основан на выделении нуклеиновых кислот из пробы совместно с предварительно внесённым внутренним контрольным образцом (ВКО) и проведении реакции обратной транскрипции и амплификации выбранного фрагмента РНК или амплификации выбранного фрагмента ДНК с детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени.

Для удобства пользователя при работе с набором рекомендуется применение магнитного штатива. Возможно выделение нуклеиновых кислот из 100 и 200 мкл пробы.

В состав ПЦР наборов серии «РеалБест» входит положительный контрольный образец (ПКО), соответствующий данному ПЦР набору. ПКО должен проходить процедуру выделения наравне с исследуемыми пробами и отрицательным контрольным образцом (ОКО).

2. Состав набора:

Комплект реагентов для выделения НК:

Ÿ   лизирующий раствор — 8 фл. по 4 мл;

Ÿ   осадитель НК — 4 фл. по 12 мл;

Ÿ   раствор для отмывки № 1 — 4 фл. по 8 мл;

Ÿ   раствор для отмывки № 2 — 4 фл. по 5 мл;

Ÿ   элюирующий раствор — 12 фл. по 3 мл;

Ÿ   сорбент (суспензия магнитных частиц) — 1 фл., 1 мл.

Комплект контрольных образцов:

Ÿ   раствор для восстановления контрольных образцов (РВК)- 2 фл. по 4 мл;

Ÿ   отрицательный контрольный образец (ОКО) — 2 фл. по 2 мл;

Ÿ   внутренний контрольный образец (ВКО), лиофилизированный,- 2 фл.

Ÿ   Набор дополнительно комплектуется пластиковыми крышками для флаконов с контрольными образцами — 2 шт.

3. Технические характеристики набора

3.1. Эффективность выделения (по РНК ВГС) — 100%.

4. Оборудование и материалы

‒         одноразовые наконечники для пипеток с защитным фильтром /аэрозольным барьером (фирма «FinnTip», Финляндия или аналогичные);

‒         одноразовые наконечники для пипеток (фирма FinnTip», Финляндия);

‒         одноразовые полипропиленовые пробирки на 2,0 мл (фирма «SSI», США, кат. № 2340 или аналогичные);

Спасибо за вашу заявку!

Наши сотруднки скоро свяжутся с вами

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка диагностической значимости комплексного выявления маркеров инфекций, переносимых клешами, у пациентов, пострадавших от их присасывания

Н.В. Яковчиц1, Е.И. Андаев1, Е.И. Бондаренко2, Ю.Н. Трушина1, И.В. Котова3, Г.Б. Пыринова2, Т.Г. Веткина2, С.Г. Баранова2, Н.Г. Топычканова2, В.И. Офицеров2

ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора : ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск

; ОГБУЗ «Иркутская областная инфекционная клиническая больница»

Цель работы — комплексное лабораторное исследование с использованием методов иммунофермент-ного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) переносчиков клещевых инфекций, а также пациентов, лихорадящих после присасывания клеща, с оценкой значимости полученных результатов для дифференциальной диагностики.

Материал и методы. Исследовали 191 имаго Ixodespersulcatus и клинический материал от 65 пациентов с лихорадочным состоянием после присасывания клеща. В образцах от переносчиков и пробах крови проводили обнаружение генетического материала возбудителей методом ПЦР в реальном времени. Сыворотки крови больных исследовали на наличие антител IgM и IgG с помощью ИФА.

Результаты. Установлено, что переносчики чаще всего заражены боррелиями (51,9+6,8%), в том числе Borrelia miyamotoi (10,4+2,8%). Остальные возбудители встречались гораздо реже: от 18,1 до 3,6% случаев. При исследовании клинического материала в 21 случае на основании гено- или серологической диагностики был поставлен диагноз «клещевой энцефалит». У 10 больных обнаружены антитела к возбудителям клещевого боррелиоза и/или генетический материал этих патогенов, причем этиологической причиной лихорадки у 5 человек была Borrelia miyamotoi.

Заключение. По результатам комплексных лабораторных исследований было установлено, что основной причиной лихорадки после присасывания клеща является инфицирование клещевым энцефалитом. Выявляемость боррелий, несмотря на высокий уровень зараженности ими переносчиков, в 2 раза ниже.

Ключевые слова:

Borrelia miyamotoi,

боррелиоз,

клещевые

инфекции,

клещевая

возвратная

лихорадка,

полимеразная

цепная реакция

Evaluation of diagnostic significance of complex detection of the tick-borne infection markers

in the patients suffered from its bites

N.V. Yakovchits1, E.I. Andaev1, 1 Irkutsk AntipLague Research Institute

E.I. Bondarenko2, Yu.N. Trushina1, 2 Closed Corporation «Vector-Best», Novosibirsk

I.V. Kotova3, G.B. Pyrinova2, 3 Irkutsk Regional CLinicaL Hospital

T.G. Vetkina2, S.G. Baranova2,

N.G. Topychkanova2, V.I. Ofitserov2

Object — complex Laboratory examination of tick-borne infection vectors and the patients with fever after a tick bite was performed using ELISA and polymerase chain reaction (PCR) methods. Significance of the results was estimated for differential diagnostics of the tick-borne infections.

Material and methods. Total 191 Imago ticks (Ixodes persulcatus) and clinical samples from 65 patients with a fever after the tick bites were included in the work. Genetic material of the causative agents was revealed by real time PCR method. Blood sera were examined for presence of the specific antibody to IgM and IgG by ELISA.

Results. It is established that most carriers infected borrelia (51.9+6.8%), including Borrelia miyamotoi 10.4+2.8%. The remaining pathogens are much less common, from 18.1 to 3.6%. In the study of clinical data in 21 cases on the basis of genotype or serological diagnosis was diagnosed with «encephalitis». In 10 patients with antibodies to pathogens borreliosis and/or genetic material of the pathogen, the etiological cause of fever in five was Borrelia miyamotoi.

Conclusion. According to the results of comprehensive laboratory testing, it was found that the main cause of fever after tick bites is infected with tick-borne encephalitis. The detection of Borrelia, despite the high level of contamination of carriers, two times lower.

Keywords:

Borrelia miyamotoi, borreliosis, tickborne infection, returnable fever, rickettsiosis, real time polymerase chain reaction

В России инфекции, переносимые клещами (ИПК), составляют подавляющую часть всех ежегодно регистрируемых случаев природно-очаговых болезней и представляют наибольшую эпидемическую опасность, поскольку могут протекать в тяжелой форме, приводящей к инвалидности и даже к летальному исходу. Клещи являются переносчиками возбудителей вирусной и бактериальной природы, способны при присасывании передавать их человеку.

В Российской Федерации к наиболее распространенным ИПК относят иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ), клещевой энцефалит (КЭ) и клещевые риккетсиозы (КР). В 2015 г. заболеваемость ИКБ в России составила 4,90 на 100 тыс. населения (зарегистрировано 7152 случая), соответствующие показатели для КЭ составили 1,58 на 100 тыс. населения (2300 случая), а КР — 1,37 на 100 тыс. населения (2004 случая) [1]. Ранняя диагностика и дифференциация этих инфекций имеют важное практическое значение для проведения своевременной и адекватной терапии, а она для заболеваний бактериальной и вирусной этиологии кардинально отличается. Однако дифференциальная диагностика ИПК представляет серьезную проблему. Это связано с тем, что данные инфекции локализованы в одних и тех же природных очагах, имеют сезонный характер, примерно одинаковый инкубационный период и общих переносчиков, в организме которых могут персистировать 2 и более возбудителя ИПК одновременно. Кроме того, для них характерны сходные клинические проявления, особенно в начальный период: озноб, лихорадка, слабость, ломота в теле, синдром интоксикации. Относительно недавно в ряд возбудителей ИПК была включена спирохета Borrelia miyamotoi, отне-

сенная к группе возбудителей клещевых возвратных лихорадок (КВЛ) [2]. Клинические симптомы КВЛ, вызываемой B. miyamotoi (КВЛ-БМ), во многом совпадают с описанными выше [3-5]. Этот патоген, так же как другие возбудители ИПК, переносится клещами рода Ixodes и имеет общие с ними ареалы на территории Евразии и Северной Америки [6-10].

Предварительный диагноз ИПК основан на данных эпидемиологического анамнеза и результатах клинического обследования. При этом более чем у 25% заболевших присасывание клеща остается незамеченным [11]. Характерные клинические признаки, позволяющие диагностировать и дифференцировать заболевание, имеют ИКБ и КР, а у КЭ и КВЛ-БМ они отсутствуют. Патогномоничный симптом ИКБ — кольцевая мигрирующая эритема (МЭ), возникающая на месте присасывания клеща, однако показано, что у 25-50% больных МЭ может не быть [12, 13]. Для КР характерным клиническим проявлением является первичный аффект (ПА) в виде инфильтрата с некротической коркой в центре, который образуется у инфицированных пациентов в месте присасывания клеща. Вместе с тем опубликованы данные о том, что в группе заболевших КР более чем в 50% случаев ПА отсутствовал [14]. Кроме того, подобная кожная реакция встречается при туляремии [15].

Предварительный диагноз инфекционного заболевания требует подтверждения лабораторными методами, с помощью которых у обследуемых выявляют возбудитель, его антигены или нуклеиновые кислоты, а также определяют специфичные антитела. Лабораторная диагностика ИПК основана на серологических исследованиях, в которых используют ре-

акции агглютинации, непрямой гемагглютинации, связывания комплемента, непрямой иммунофлюоресценции, а также иммуноферментный анализ (ИФА), получивший в настоящее время наиболее широкое распространение. В России зарегистрированы и разрешены для применения в лабораторной практике наборы реагентов для выявления методом ИФА иммуноглобулинов классов M и G (IgM и IgG) к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ) и к возбудителям ИКБ (B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii). Однако коммерческих тестов для серодиагностики клещевых риккетсиозов и КВЛ-БМ пока не существует.

Анализ данных литературы показал, что в сыворотках крови пациентов, взятых в ранние сроки заболевания, антитела к возбудителям ИПК в большинстве случаев не выявляются. В лучшем случае специфичные IgM-антитела обнаруживают на 10-14-й день от начала болезни, а IgG — еще через 7-10 сут.

Проведено большое число исследований по лабораторному подтверждению диагноза этих природно-очаговых болезней путем выявления участков нуклеиновых кислот (НК) возбудителей ИПК, амплифицированных полимераз-ной цепной реакцией (ПЦР). Однако генетический материал ВКЭ определяется в крови инфицированных людей в первые 1-4 дня после присасывания клеща только в 55% случаев, а затем вероятность его обнаружения резко снижается [16]. Чувствительность выявления НК возбудителей ИКБ в крови с использованием ПЦР на 1-й неделе заболевания составляет лишь 20-35% [17], а при анализе биоптатов МЭ — 60% [18]. Более эффективным было применение этого метода для детекции генетических маркеров КР, которые определялись в 100% исследованных биоптатов первичного аффекта и в смывах с него, а также в образцах лейкоцитарной фракции крови (ЛФК) инфицированных людей с диагностической чувствительностью 70-82% [19]. При исследовании в режиме реального времени (ПЦР-РВ) показано, что концентрация B. miyamotoi в крови инфицированных пациентов в период повторяющейся лихорадки варьирует от несколько сотен до 106 боррелий в 1 мл [20].

Отсутствие в Российской Федерации диагностических тест-систем для серодиагностики КР и КВЛ-БМ, а также недостаточная чувствительность ПЦР при выявлении НК возбудителей КЭ и ИКБ серьезно осложняют дифференциальную лабораторную диагностику ИПК. Дополнительные проблемы создает наличие в присосавшемся клеще 2 и более возбудителей данных инфекций. Все это может приводить к постановке ошибочного диагноза, в результате чего больные не получают своевременного адекватного лечения. Так, ранее было показано, что в крови ряда пациентов с предварительным диагнозом КЭ, лихорадящих после присасывания клеща, была выявлена НК B. miyamotoi [21, 22]. Очевидно, что в эндемичных по КР регионах при обследовании лихорадящего больного, пострадавшего от присасывания клеща, может быть выставлен ошибочный предварительный диагноз, а истинным возбудителем заболевания являются B. miyamotoi или ВКЭ [5].

Таким образом, для повышения точности диагностики ИПК необходимо использовать комплекс лабораторных методов, включающий выявление у обследуемых серологиче-

ских и генетических маркеров всех возбудителей данных инфекций, циркулирующих на территории природных биоценозов конкретного региона.

Цель настоящей работы — комплексное лабораторное исследование с использованием методов ИФА и ПЦР переносчиков клещевых инфекций, а также пациентов, лихорадящих после присасывания клеща, с оценкой значимости полученных результатов для дифференциальной диагностики инфекций.

Материал и методы

Исследовали 191 имаго клеща I. persulcatus, собранных в апреле-мае 2014 г. на флаг в Эхирит-Булагатском районе Иркутской области, а также на территориях, прилегающих к Голустенскому и Байкальскому трактам, на расстоянии 23, 43 и 47 км от Иркутска соответственно. Идентификацию клещей сначала проводили по морфологическим признакам [23], а затем анализировали индивидуально. При подготовке к исследованию клеща последовательно промывали в 70% этиловом спирте, в 0,9% растворе хлорида натрия с добавлением антибиотика (pH 7,4 + пенициллин, 100 ЕД/мл), а затем в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия (pH 7,4). Отмытого клеща помещали в пробирку с 500 мкл раствора для подготовки образцов [РПО из наборов реагентов серии «РеалБест»; ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск)] и измельчали с помощью гомогенизатора TissueLyser LT (Qiagen, Германия) при частоте 50 Гц. Выделение суммарной НК из полученных суспензий проводили с использованием наборов реагентов «РеалБест экстракция 100» (ЗАО «Вектор-Бест») согласно инструкции производителя.

Исследована кровь от 65 пациентов, поступивших на лечение в стационар Иркутской областной инфекционной больницы в весенне-летний период 2014 г. Критериями отбора проб крови стали лихорадочное состояние больных и факт присасывания к ним клеща до начала заболевания.

Образцы крови для анализа ПЦР-РВ у пациентов забирали натощак в пробирки S-Monovette (Sarstedt, Германия), содержащие ЭДТА. Для получения лейкоцитарной фракции крови (ЛФК) 2 мл полученной крови центрифугировали 10 мин при 800 об/мин на центрифуге MiniSpin (Eppendorf, Германия). Отбирали верхний слой плазмы (около 500 мкл), переносили его в другую пробирку и центрифугировали 10 мин при 13 000 об/мин. Основную часть супернатанта удаляли, оставляя примерно 200 мкл вместе с осадком лейкоцитов, который ресуспендировали. Выделение суммарных НК из 100 мкл полученной суспензии ЛФК проводили с использованием набора реагентов «РеалБест экстракция 100».

Для серологических исследований кровь пациентов забирали в пробирки S-MonovetteZ-GeL (Sarstedt, Германия), центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин и отделяли полученные образцы сыворотки крови.

Выявление РНК ВКЭ, а также ДНК возбудителей ИКБ, КВЛ-БМ, Anaplasma phagocytophilum, вызывающей гра-нулоцитарный анаплазмоз человека (ГАЧ), Ehrlichia muris (Eh. chaffeensis) — возбудителя моноцитарного эрлихиоза человека (МЭЧ) в образцах суммарной НК, выделенной из суспензии клещей и ЛФК больных, проводили методом

ПЦР-РВ с помощью соответствующих коммерческих наборов реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест». Для определения ДНК риккетсий в ЛФК использовали лабораторную версию набора реагентов «РеалБест ДНК Rickettsia species», в которой амплифицируется консервативный фрагмент гена цитратсинтазы (gltA), имеющийся у различных представителей рода Rickettsia. Выявление генетического материала патогенных для человека видов риккетсий в клещах I. persulcatus проводили с помощью лабораторной версии набора «РеалБест ДНК R. sibirica/R. heilongjiangensis», в которой детектируются участки генов ompA R. sibirica и ompB R. heilongjiangensis.

Для наработки ампликонов фрагмента гена glpQ B. miya-motoi в качестве матрицы использовали суммарную НК, выделенную из ЛФК больных с положительным результатом ПЦР-РВ, и праймеры для прямой и обратной цепей ДНК 5′-TG CTAG TG G G TATCTTCC AG A A и 5′-TATCCAGG-GTCCAATTCCATCA соответственно, синтезированные в ЗАО «Вектор-Бест». Определение нуклеотидных последовательностей двух цепей ДНК в каждом полученном амплификате проводили на автоматическом секвенаторе ABIPrism 3100 DNAAnaLyser (AppLiedBiosystems, США) в Межинститутском центре секве-нирования ДНК Сибирского отделения РАН (Новосибирск). Для филогенетического анализа полученных нуклеотидных последовательностей применяли программу MEGA 4.0 [24], а для их сравнения с данными GenBank — поисковую систему «BLAST».

Серологические исследования проводили методом ИФА с помощью наборов реагентов «ВектоВКЭ-IgM», «ЛаймБест-IgM» и «ЛаймБест-IgG» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). Для выявления специфических IgM- и IgG-антител к B. miyamotoi в качестве антигена, сорбируемого на поверхность лунок планшет, использовали рекомбинантный белок glpQ, синтезированный по описанной ранее методике [25].

Результаты и обсуждение

В предварительном исследовании была изучена зараженность клещей разными возбудителями ИПК. Для этого в выборке клещей методом ПЦР-РВ определяли наличие НК патогенов, вызывающих КЭ, ИКБ, КВЛ-БМ, КР, ГАЧ и МЭЧ. В результате проведенного анализа было показано, что наиболее распространенным возбудителем ИПК, циркулирующим в изученных клещах, является комплекс B. burgdorferi s.l., ДНК которых была выявлена более чем в половине случаев (табл. 1). B. miyamotoi определялась в 10,4% случаев, ВКЭ — в 3,6% из числа анализируемых клещей. Результаты этих исследований подтверждают опубликованные ранее данные о высокой зараженности клещей, распространенных на территории Иркутской области, патогенными для человека микроорганизмами [26].

Для лабораторной диагностики КЭ в сыворотке крови больных, госпитализированных с лихорадочным состоянием после присасывания клеща, с помощью ИФА определяли специфичные IgM-антитела к ВКЭ, а в образцах ЛФК методом ПЦР-РВ выявляли РНК этого вируса. Результаты серологического исследования были положительными у 20 (35,7%) из 65 пациентов, а при проведении ПЦР гене-

тический материал ВКЭ был выявлен у 2 (3,1%) из 65 больных (только у одного были одновременно обнаружены и антитела к ВКЭ, и вирусная РНК). На основании полученных данных диагноз «клещевой энцефалит» был поставлен 21 (32,3%) из 65 обследованных больных.

При тестировании образцов ЛФК пациентов методом ПЦР-РВ выявить ДНК возбудителей ИКБ не удалось, а генетический материал B. miyamotoi был обнаружен в 3 (4,6%) случаях. Поскольку эта инфекция все еще недостаточно изучена, подробно охарактеризованы 3 случая заражения B. miyamotoi. Для оценки количества B. miyamotoi в крови этих пациентов использовали результаты определения порогового цикла (Ct), полученные при проведении ПЦР-РВ с помощью набора реагентов «РеалБест ДНК Borrelia miyamotoi». Концентрация возбудителя в цельной крови одного пациента составила около 50, а у двух других -2000-4000 боррелий/мл. Очевидно, высокое содержание в кровотоке B. miyamotoi и продуктов их деградации, образующихся в результате защитных реакций иммунной системы, вызывает пирогенный эффект, проявляющийся у больного в виде лихорадки.

С целью подтверждения видовой принадлежности этих возбудителей было проведено определение нуклео-тидной последовательности фрагмента гена glpQ длиной 680 пар нуклеотидов. Ранее было показано, что этот ген отсутствует у боррелий комплекса B. burgdorferi s.l., а также у других возбудителей ИПК, встречающих на территории РФ [20, 21]. В результате анализа полученных нуклеотидных последовательностей была подтверждена их принадлежность B. miyamotoi и установлена полная идентичность последовательностям фрагмента гена glpQ, который был ранее депонирован в базе данных GeneBank из Екатеринбурга (KJ950116, KJ950117, KJ950118, KJ950119) и Владивостока (KU169374). Таким образом, полученные данные подтвердили, что причиной лихорадочного состояния у 3 больных стало заражение B. miyamotoi в результате присасывания инфицированного клеща.

При серологических исследованиях с использованием наборов реагентов «ЛаймБест-IgM» и «ЛаймБест-IgG» специфичные антитела к антигенам боррелий комплекса B. burgdorferi s.l. были обнаружены у 7 (9,2%) из 65 пациентов (табл. 2).

Таблица 1. Результаты выявления нуклеиновых кислот (НК) возбудителей инфекций, переносимых клещами, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в клещах I. persulcatus, собранных в Иркутской области

Нозологиче- Количество НК возбудителя

ская форма исследован- абс. %±m

ных клещей

ИКБ 54 28 51,9±6,8

КВЛ-БМ 115 12 10,4±2,8

КЭ 83 3 3,6±2,0

ГАЧ 83 15 18,1±4,2

МЭЧ 83 6 7,2±2,8

КР 76 0 0

Примечание. Расшифровка сокращений дана в тексте статьи.

Таблица 2. Результаты исследования образцов крови методами иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Обследуемые Результат выявления Результат определения специфичных антител к антигенам

пациенты (№) НК B. miyamotoi ПЦР- комплекса B. burgdorferi s.l. glpQ B. miyamotoi

РВ (значения Ct) IgM IgG IgM IgG

4 — — — + —

11 + (29) + — + —

15 + (35) — — — —

19* — — + — —

26 — + — +

30 — + + — —

38 + (29) + + + —

42 — — — + +

47 — + + — —

51 — + — — —

Примечание. * — в сыворотке крови этого пациента также были выявлены 1&М к вирусному клещевому энцефалиту; НК — нуклеиновые кислоты.

В 2 образцах ЛФК крови (№ 11 и 38) из этих 7 больных методом ПЦР-РВ была обнаружена ДНК B. miyamotoi. Это согласуется с опубликованными ранее данными о том, что в тестах для определения IgM и IgG к возбудителям ИКБ выявляются также антитела к боррелиям группы КВЛ (B. persica, B. miyamotoi), поскольку в данных диагностических наборах применяются общие для этих генетических групп белковые антигены [22, 27].

Для определения специфичных антител к B. miyamotoi в сыворотке крови обследуемых пациентов с помощью ИФА был использован рекомбинантный белок glpQ, который, как было показано ранее, отсутствует у боррелий комплекса B. burgdorferis.l. [25, 28]. В результате применения этой методики у 5 (9,2%) из 54 больных были выявлены антитела к glpQ B. miyamotoi.

На основании анализа комплекса данных, полученных при выявлении генетических и серологических маркеров возбудителей ИКБ и КВЛ-БМ в клинических образцах обследуемых пациентов, можно сделать следующие выводы.

Этиологической причиной лихорадки у 5 больных (№ 4, 11, 15, 38 и 42), очевидно, являлась инфекция B. miyamotoi. Кроме того, нельзя исключить контакт с этим возбудителем пациента № 26, в крови которого выявлены IgG-антитела к белку glpQ боррелий группы КВЛ, однако для подтверждения диагноза требуются дополнительные исследования.

Результаты серологического анализа подтверждают диагноз «иксодовый клещевой боррелиоз» для 3 больных (№ 30, 47 и 51). В сыворотке крови пациента № 19 были выявлены одновременно IgG-антитела к антигенам боррелий комплекса B. burgdorferi s.l., а также IgM-антитела к ВКЭ и поставлен диагноз «клещевой энцефалит». Очевидно, для подтверждения ИКБ, сочетанного с КЭ, необходимо проведение дополнительных исследований, в том числе анализ парных сывороток крови пациента в динамике.

При тестировании ЛФК 65 больных с помощью лабораторной версии набора реагентов «РеалБест ДНК Rickettsia species» ДНК этих возбудителей была выявлена в 2 (3,1%) случаях. Данный тест не позволяет установить вид риккет-сий. Попытка уточнить вид этих возбудителей в результате секвенса образцов ДНК, выделенной из ЛФК больных, была

безуспешной, что, по-видимому, обусловлено низкой концентрацией риккетсий в образцах, поскольку значения и (37 и 38), полученные при проведении ПЦР-РВ, соответствовали 20-40 микроорганизмов в 1 мл цельной крови. Серологическое обследование пациентов на риккетсиоз не проводили, так как в Российской Федерации в настоящее время нет соответствующих диагностических наборов реагентов.

Причиной относительно невысокой выявляемости генетического материала возбудителей ИПК методом ПЦР-РВ может быть несвоевременный забор образцов исследуемой крови у больных (не в пик лихорадки, а уже при нормализовавшейся температуре, когда патоген элиминирован из кровотока). Кроме того, некоторые пациенты принимали антибиотики и/или жаропонижающие препараты, что также способствует снижению количества некоторых возбудителей ИПК, циркулирующих в крови. Низкая эффективность серологической диагностики боррелиозных инфекций может быть связана с тем, что взятие крови для данных исследований проводили в ранние сроки заболевания, когда специфические антитела еще только начинают вырабатываться.

В результате проведенного исследования с помощью ПЦР-РВ НК возбудителей ГАЧ и МЭЧ в ЛФК выявить не удалось ни у одного из 65 больных с лихорадочным состоянием, возникшим после присасывания клеща. Вместе с тем при тестировании этим методом 83 клещей I. persulcatus, собранных в Иркутской области, было показано, что их зараженность A. phagocytophilum достигает 18,1%, а E. muris/E. chaffe-ensis — 7,2% (см. табл. 1). Это совпадает с опубликованными ранее результатами исследований, в которых также отмечено, что у людей, пострадавших от присасывания клеща в двух регионах России, не было случаев выявления генетических маркеров ГАЧ и МЭЧ [20-22]. При этом наличие НК возбудителей данных заболеваний достаточно часто определяется как в клещах, так и в крови их прокормите-лей (мышевидных грызунов) на территории ряда регионов России [29-31].

Таким образом, в результате комплексного лабораторного исследования с использованием методов ИФА и ПЦР 65 больных, лихорадящих после присасывания клеща, у 21 из них был диагностирован КЭ, у 5 — КВЛ B. miyamotoi,

у 3 — ИКБ и у 2 — КР. В целом этиология лихорадочного состояния пациентов, пострадавших от нападения клеща, была установлена на ранней стадии болезни в 47,7% случаев. Эффективность лабораторной диагностики инфекций, переносимых клещами, может возрасти, если в России появятся все необходимые наборы реагентов (как для ИФА, так и ПЦР), которые сейчас отсутствуют на рынке.

Результаты проведенных исследований подтвердили опубликованные ранее данные о высокой зараженности

клещей, распространенных на территории Иркутской области, возбудителями ряда природно-очаговых инфекций. Поэтому большое значение для выявления ИПК могут иметь результаты анализа снятого с человека клеща на зараженность этими патогенами. Полученная информация способствует постановке пациенту правильного диагноза, позволяет снизить его психологическое напряжение, а при выявлении ВКЭ или патогенных боррелий может быть использована врачом для назначения экстренной превентивной терапии.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Яковчиц Николай Васильевич — младший научный сотрудник лаборатории природно-очаговых вирусных инфекций ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора E-mail: nyakovchits@gmaiL.com, nikoLaybio@maiL.ru

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Андаев Евгений Иванович — заместитель директора по общим вопросам и организационно-методической работе, заведующий лабораторией природно-очаговых вирусных инфекций ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора E-mail: e.andaev@gmail.com

Бондаренко Евгений Иванович — научный сотрудник лаборатории ПЦР ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск E-mail: ebondarenko@ngs.ru

Трушина Юлия Николаевна — младший научный сотрудник лаборатории природно-очаговых вирусных инфекций ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора E-mail: trushinauylia@yandex.ru

Котова Ирина Владимировна — заведующая диагностическим отделением ОГБУЗ «Иркутская областная инфекционная клиническая больница» E-mail: KIV-2010@list.ru

Пыринова Галина Борисовна — заведующая лабораторией рекомбинантных белков ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск E-mail: common@vector-best.ru

Вяткина Тамара Геннадьевна — заведующая отделением ИФА сифилиса ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск E-mail: common@vector-best.ru

Баранова Светлана Германовна — ведущий микробиолог отделения ИФА сифилиса ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск E-mail: common@vector-best.ru

Топычканова Наталья Григорьевна — старший научный сотрудник лаборатории маркеров вирусных инфекций ЗАО «Вектор-

Бест», Новосибирск

E-mail: common@vector-best.ru

Офицеров Вячеслав Иванович — заместитель генерального директора по научной работе ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск E-mail: common@vector-best.ru

ЛИТЕРАТУРА

1. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации за январь-ноябрь 2015 года. Доступ 10 февраля 2016 г.: http://www. rospotrebnadzor.ru/activities/statisticaL-materiaLs/statictic_detaiLs. php?ELEMENT_ID=5420

2. Fukunaga M., Takahashi Y., Tsuruta Y. et aL. Genetic and phenotypic anaLysis of BorreLia miyamotoi sp. nov., isoLated from the ixodid tick Ixodes persuLcatus, the vector for Lyme disease in Japan // Int. J. Syst. BacterioL. 1995, N 45. P. 804-810.

3. Платонов А.Е., Карань Л.С., Колясникова Н.М. и др. Таксономическая позиция и генетическое разнообразие вида боррелий BorreLia miyamotoi — возбудителя «нового» иксодового клещевого бор-релиоза // Материалы конференции «Молекулярная диагностика -2010». Т. 2. М., 2010. С. 250-256.

4. Платонов А.Е., Малеев В.В., Карань Л.С. Боррелиозные возвратные лихорадки: забытые и новые // Тер. архив. 2010. Т. 82.

№ 11. С. 74-80. 5. Томилка Г.С., Мокрецова Е.В., Бондаренко Е.И. Иксодовый клещевой боррелиоз, вызываемый Borrelia miyamotoi, на юге Хабаровского края // Журнал инфектологии. 2015. № 3. С. 84.

5. Томилка Г.С., Мокрецова Е.В., Бондаренко Е.И. Иксодовый клещевой боррелиоз, вызываемый Borrelia miyamotoi, на юге Хабаровского края // Журнал инфектологии. 2015. № 3. С. 84.

6. Карань Л.С., Рудникова Н.А., Булгакова Т.А. ПЦР-диагностика клинических случаев боррелиозов и риккетсиозов // Сборник трудов конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний». М., 2004. Т. 2. С. 35-37.

7. Леонова Г.Н., Бондаренко Е.И., Хворостянко А.А. и др. Изучение распространенности на юге Дальнего Востока возбудителей инфекций, передаваемых иксодовыми клещами // Эпидемиология и вакцинопро-филактика. 2015. № 1. С. 31-35.

8. Barbour A.G., Bunikis J., Travinsky B. et aL. Niche partitioning of BorreLia burgdorferi and BorreLia miyamotoi in the same tick vector and mammalian reservoir species // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2009. N 6. P. 1120-1131.

9. Fukunaga M., Okada K., Nakao M. et aL. PhyLogenetic analysis of BorreLia species based on fLageLLin gene sequences and its application for moLecuLar typing of Lyme disease borreLiae // Int. J. Syst. BacterioL. 1996. N 46. P. 898-905.

10. Karan L.S., Rudnikova N.A., PLatonov A.E. et aL. Ixodes tickborne borreLioses in Russia // 5th InternationaL Conference on Emerging Zoonoses. LimassoL, Cyprus. 2007. P. 350.

11. Деконенко Е.П. Клинико-эпидемиологические особенности Лайм-боррелиоза // Врач. 2004. № 2. С. 24-28.

12. Манзенюк И.Н., Манзенюк О.Ю. Клещевые боррелиозы (болезнь Лайма). Пособие для врачей. Кольцово, 2005. 85 с.

13. Лобзин Ю.В., Рахманова А.Г., Антонов В.С. и др. Эпидемиология, этиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика иксодовых клещевых боррелиозов. Рекомендации для врачей. Санкт-Петербург. 2000. [Электронный ресурс]. URL: http://www.epid.ru/docs/infdoc5. htmL. (Дата обращения: 12.02.2016).

14. Мокрецова Е.В., Карань Л.С., Томилка Г.С. Клещевой риккет-сиоз на юге Хабаровского края // Журнал инфектологии. 2015. № 3. С. 61-62.

15. Еремеева М.Е., Шпынов С.Н., Токаревич Н.К. Современные подходы к лабораторной диагностике риккетсиозов // Инфекция и иммунитет. 2014. № 3. С. 113-134.

16. ПЦР-диагностика клещевого энцефалита. [Электронный ресурс]. URL: http://www.mcstatus.ru/content/ptsr-diagnostika-kLeshchevogo-entsefaLita. (Дата обращения: 3.02.2016).

17. Покровский В.И., Творогова М.Г., Шипулин Г.А. (ред.) Лабораторная диагностика инфекционных болезней. Справочник. М.: БИНОМ; 2013. 254 с.

18. Малеев В.В. Обзор Европейских рекомендаций по диагностике клещевых бактериальных инфекций // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2005. Т. 7. № 2. С. 130-153.

19. Карань Л.С., Щучинова Л.Д., Мокрецова Е.В. и др. Диагностическая чувствительность ПЦР-метода при исследовании разных типов клинического материала у больных риккетсиозами группы клещевых пятнистых лихорадок // Журнал инфектологии. 2015. № 3. С. 42-43.

REFERENCES

1. Infectious morbidity in the Russian Federation in January-November 2015. Accessed February 10, 2016. (in Russian)

2. Fukunaga M., Takahashi Y., Tsuruta Y., et al. Genetic and phenotypic analysis of Borrelia miyamotoi sp. nov., isolated from the ixodid tick Ixodes persulcatus, the vector for Lyme disease in Japan. Int J Syst Bacteriol. 1995; 45: 804-10.

3. Platonov A.E., Karan’ L.S., Kolyasnikova N.M., et al. Taxonomic position and the genetic diversity of species of Borrelia Borrelia miyamotoi -«new» pathogen Ixodes tick borreliosis. In: Materialy konferentsii «Mole-kulyarnaya diagnostika — 2010» [Materials of the Conference «Molecular Diagnostics — 2010»]. Vol. 2. Moscow; 2010: 250-6. (in Russian)

4. Platonov A.E., Maleev V.V., Karan’ L.S. Relapsing fever borrelioses: forgotten and new ones. Terapevticheskiy arkhiv [Therapeutic Archive]. 2010; Vol. 82 (11): 74-80. (in Russian)

20. Бондаренко Е.И., Позднякова Л.Л., Сибирцева С.Г., и др. Набор реагентов для выявления BorreLia miyamotoi — возбудителя клещевой возвратной лихорадки методом ПЦР в режиме реального времени // Новости «Вектор-Бест». 2013. № 1. С. 2-9.

21. Бондаренко Е.И., Сибирцева С.Г., Ткачев В.К. и др. Дифференциальный подход к выявлению боррелий в клещах и клинических образцах с помощью ПЦР-анализа в режиме реального времени с использованием наборов серии «Реал-Бест» // Материалы конференции «Молекулярная диагностика, 2010». М., 2010. Т. 1. С. 503-504.

22. PLatonov A.E., Karan L.S., KoLyasnikova N.M. Humans infected with the reLapsing fever spirochete BorreLia miyamotoi, Russia // Emerg. Infect. Dis. 2011. N 10. P. 1816-1822.

23. Филиппова Н.А. Иксодовые клещи подсемейства Ixodinae. В кн.: Фауна СССР. Паукообразные. Ленинград: Изд-во АН СССР, 1977. Т. 4. 396 с.

24. Tamura K., DudLey J., Nei M., et aL. MEGA4: MoLecuLar EvoLutionary Genetics AnaLysis (MEGA) software version 4.0 // MoL. BioL. EvoL. 2007. VoL. 8, N 24. P. 1596-1599.

25. Krause P.J., Narasimhan S., Wormser G.P. et aL. BorreLia miyamotoi sensu Lato seroreactovity and seroprevaLence in the northeastern United States // Emerg. Infect. Dis. 2014. № 20. P. 1183-1190.

26. Аитов К.А. Природно-очаговые трансмиссивные клещевые инфекции Прибайкалья: Дисс. … д-ра мед. наук. Иркутск, 2005.

27. Сарксян Д.С. Иксодовые клещевые боррелиозы — современное состояние проблемы // Инфекционные болезни. 2015. № 2. С. 61-67.

28. Krause P.J., Narasimhan S., Wormser G.P. et aL. Human BorreLia miyamotoi infection in the United States // N. EngL. J Med. 2013. № 3. P. 291-293.

29. Бондаренко Е.И., Иванов М.К., Якименко В.В. и др. Использование полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления ДНК возбудителей гранулоцитарного анаплазмоза и моноци-тарного эрлихиоза человека // Клиническая лабораторная диагностика. 2012. № 11. С. 54-57.

30. Бондаренко Е.И., Титов С.Е., Иванов М.К. Выявление возбудителей гранулоцитарного анаплазмоза человека и моноцитарного эрлихиоза человека методом ReaL-time ПЦР // Новости «Вектор-Бест». 2012. № 1. С. 2-8.

31. Рар В.А., Епихина Т.И., Тикунова Н.В. и др. Выявление ДНК переносимых иксодовыми клещами патогенов в крови мелких млекопитающих в лесной зоне среднего Прииртышья (Омская область, Западная Сибирь) // Паразитология. 2014. № 1. С. 37-53.

5. Tomilka G.S., Mokretsova E.V., Bondarenko E.I. Ixodes tick-borne Lyme disease caused by Borrelia miyamotoi, in the south of Khabarovsk Territory. Zhurnal infektologii [Journal Infectology]. 2015; 3: 84. (in Russian)

6. Karan’ L.S., Rudnikova N.A., Bulgakova T.A. PCR diagnosis of clinical cases of borreliosis and rickettsial diseases. In: Sbornik trudov konferentsii «Genodiagnostika infektsionnykh zabolevaniy» [Proceedings of the Conference «Molecular Diagnostics of Infectious Diseases»]. Moscow. 2004; Vol. 2: 35-7. (in Russian)

7. Leonova G.N., Bondarenko E.I., Khvorostyanko A.A., et al. Study Distribute Pathogens of Tick-Borne Infections, Transmitted of Ticks in the South of the Far East. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika [Epidemiology and Vaccinal Prevention]. 2015; (1): 31-5. (in Russian)

8. Barbour A.G., Bunikis J., Travinsky B., et al. Niche partitioning of Borrelia burgdorferi and Borrelia miyamotoi in the same tick vector

and mammalian reservoir species. Am J Trop Med Hyg. 2009; (6): 1120-31.

9. Fukunaga M., Okada K., Nakao M., et aL. PhyLogenetic analysis of Borrelia species based on fLageLLin gene sequences and its application for molecular typing of Lyme disease borreLiae. Int J Syst BacterioL. 1996; (46): 898-905.

10. Karan L.S., Rudnikova N.A., PLatonov A.E., et aL. Ixodes tick-borne borreLioses in Russia. In: 5th InternationaL Conference on Emerging Zoonoses. LimassoL, Cyprus. 2007: 350.

11. Dekonenko E.P. CLinicaL and epidemioLogicaL features of Lyme bor-reLiosis. Vrach [Doctor]. 2004: (2): 24-8. (in Russian)

12. Manzenyuk I.N., Manzenyuk O.Yu. KLeshchevye borreLiozy (boLezn’ Layma) [Lyme borreLiosis (Lyme disease)]. ManuaL for physicians. KoL’tsovo; 2005: 85 p. (in Russian)

13. Lobzin Yu.V., Rakhmanova A.G., Antonov V.S., et aL. EpidemioLogiya, etioLogiya, kLinika, diagnostika, Lechenie i profiLaktika iksodovykh kLesh-chevykh borreLiozov. Rekomendatsii dLya vrachey [EpidemioLogy, etioLogy, cLinicaL features, diagnosis, treatment and prevention of Ixodes tick borreLiosis. Recommendations for doctors]. St. Petersburg. 2000. [ELectronic resource]. URL: http://www.epid.ru/docs/infdoc5.htmL. (Date of the appLication: 12.02.2016). (in Russian)

14. Mokretsova E.V., Karan’ L.S., TomiLka G.S. Tick-borne rickettsial disease in the south of Khabarovsk Territory. ZhurnaL infektoLogii [JournaL InfectoLogy]. 2015; (3): 61-2. (in Russian)

1. Eremeeva M.E., Shpynov S.N., Tokarevich N.K. Modern approaches to Laboratory diagnosis of rickettsiaL diseases . Infektsiya i immunitet [Russian JournaL of Infection and Immunity]. 2014; (3): 113-4. (in Russian)

16. PCR diagnosis of tick-borne encephaLitis. [ELectronic resource]. URL: http://www.mcstatus.ru/content/ptsr-diagnostika-kLeshchevogo-entsefaLita. (Date of the appLication: 3.02.2016). (in Russian)

17. Pokrovskiy V.I., Tvorogova M.G., ShipuLin G.A., eds. Laboratory diagnosis of infectious diseases. Directory. Moscow: BINOM; 2013: 254 p.

18. MaLeev V.V. Review of GuideLines for the Diagnosis of Tick-Borne BacteriaL Diseases in Europe. KLinicheskaja mikrobioLogija i antimikrobnaja himioterapija [CLinicaL MicrobioLogy and AntimicrobiaL Chemotherapy]. 2005; VoL. 7 (2): 130-53. (in Russian)

19. Karan’ L.S., Shchuchinova L.D., Mokretsova E.V., et aL. Diagnostic PCR sensitivity of the method in the study of different types of cLinicaL data in patients with tick-borne rickettsiaL disease spotted fever group. ZhurnaL infektoLogii [JournaL InfectoLogy]. 2015; (3): 42-3. (in Russian)

20. Bondarenko E.I., Pozdnyakova L.L., Sibirtseva C.G., et aL Reagent kit for the detection of Borrelia miyamotoi — the causative agent of tickborne relapsing fever by PCR in real time. Novosti «Vektor-Best» [News «Vector-Best»]. 2013; (1): 2-9. (in Russian)

21. Bondarenko E.I., Sibirtseva C.G., Tkachev V.K., et aL Differential approach to the identification of Borrelia in ticks and clinical samples by PCR analysis in real-time using a set of «Real-Best» series. In: Materialy konferentsii «Molekulyarnaya diagnostika» [Proceedings of the Conference «Molecular Diagnostics, 2010»]. Moscow. 2010; Vol. 1: 503-4. (in Russian)

22. Platonov A.E., Karan L.S., Kolyasnikova N.M. Humans infected with the relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi, Russia. Emerg Infect Dis. 2011; (10): 1816-22.

23. Filippova N.A. Ticks subfamily Ixodinae. In: Fauna SSSR. Paukoo-braznye [Fauna of the USSR. Arachnids]. Leningrad: Publishing House of the USSR Academy of Sciences. 1977; Vol. 4: 396 p. (In Russian)

24. Tamura K., Dudley J., Nei M., et al. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol. 2007; Vol. 8 (24): 1596-9.

25. Krause P.J., Narasimhan S., Wormser G.P., et al. Borrelia miyamotoi sensu lato seroreactovity and seroprevalence in the northeastern United States. Emerg Infect Dis. 2014; (20): 1183-90.

26. Aitov K.A. Natural focal infections transmissible chuck Pribaikalye Abstract of Diss. Irkutsk; 2005. (in Russian)

27. Sarksyan D.S. Ixodes tick-borne borrelioses — state of the art. In-fektsionnye bolezni [Infectious Diseases]. 2015; (2): 61-7. (in Russian)

28. Krause P.J., Narasimhan S., Wormser G.P., et al. Human Borrelia miyamotoi infection in the United States./ N Engl J Med. 2013; (3): 291-3.

29. Bondarenko E.I., Ivanov M.K., Yakimenko V.V., et al. The application of polymerase chain reaction in real-time operation mode to detect dna of agents of human granulocytic anaplasmosis and monocytic erlychiosis. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika [Russian Clinical Laboratory Diagnostics]. 2012; (11): 54-7. (in Russian)

30. Bondarenko E.I., Titov S.E., Ivanov M.K. Identification of pathogens and human granulocytic anaplasmosis monocytic ehrlichiosis person by Real-time PCR. Novosti «Vektor-Best» [News «Vector-Best»]. 2012; (1): 2-8. (in Russian)

31. Rar V.A., Epikhina T.I., Tikunova N.V., et al. DNA detection of pathogens transmitted by ixodid ticks in blood of small mammals inhabiting the forest biotopes in middle Irtysh area (Omsk Region, West Siberia). Parazi-tologiya [Parasitology]. 2014; (1): 37-53. (in Russian)

Наборы реагентов для выделения нуклеиновых кислот РеалБест экстракция 100